色谱  2015, Vol. 33 Issue (4): 371-376   PDF (843 KB)    
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杜彦山
李强
吴春敏
张岩
超高效液相色谱-四极杆/静电场轨道阱高分辨质谱快速筛查及定量分析保健品中11种非法添加降糖药物
杜彦山, 李强, 吴春敏, 张岩     
河北省食品检验研究院, 河北省食品安全重点实验室, 河北 石家庄 050091
收稿日期：2014-11-14
基金项目：河北省科技条件建设项目(13965504D).
通讯作者：张岩, E-mail: zhangyan@nepp.com.cn
摘要：基于超高效液相色谱-四极杆/静电场轨道阱质谱建立了保健品中11种非法添加化学降糖药(那格列奈、盐酸吡格列酮、格列喹酮、格列齐特、格列吡嗪、格列本脲、盐酸二甲双胍、瑞格列奈、盐酸苯乙双胍、盐酸罗格列酮、格列美脲)的快速筛查和定量分析方法。样品采用甲醇提取,C18色谱柱(100 mm×4.6 mm, 2.7 μm)分离,用10 mmol/L乙酸铵水溶液和乙腈进行梯度洗脱,正离子模式扫描。化合物一级质谱的分辨率为70000,二级质谱分辨率为17500。实验结果表明,11种化合物在0.005~0.5 mg/L范围内具有良好的线性(线性相关系数均大于0.99),各降糖类药物检出限为2.7~5.1 μg/kg,回收率为87.3%~98.3%,相对标准偏差为2.18%~5.21%。本方法具有准确、简便、快速的特点,可用于降糖类保健品中11种降糖药物的定性筛查和定量分析。
关键词： 超高效液相色谱     四极杆/静电场轨道阱高分辨质谱     降糖药物     保健品    
Rapid screening and quantitative detection of 11 illegally added antidiabetics in health care products by ultra performance liquid chromatography-quadrupole/electrostatic field orbitrap high resolution mass spectrometry
DU Yanshan, LI Qiang, WU Chunmin, ZHANG Yan     
Hebei Food Inspection and Research Institute, Hebei Food Safety Key Laboratory, Shijiazhuang 050091, China
Received: 2014-11-14
Abstract: A method for rapid screening and quantification of 11 antidiabetics (nateglinide, pioglitazone hydrochloride, gliquidone, gliclazide, glipizide, glibenclamide, metformin hydrochloride, repaglinide, phenformin hydrochloride, rosiglitazone hydrochloride, glimepiride) illegally added in health care products by ultra performance liquid chromatography (UPLC)-quadrupole/electrostatic field orbitrap mass spectrometry was established. The samples were extracted with methanol, and separated on an Agilent Poroshell 120 SB-C18 column (100 mm×4.6 mm, 2.7 μm) with acetonitrile-10 mmol/L ammonium acetate solution as mobile phases by gradient elution. The positive mode was used in the MS detection. The resolution of the precursor mass was 70000, while the resolution of the product mass was 17500. The results indicated that the linearity of all the 11 antidiabetics ranged from 0.005 mg/L to 0.5 mg/L with the correlation coefficients greater than 0.99. The limits of detection were confirmed by spiked samples, and were between 2.7 and 5.1 μg/kg for the 11 antidiabetics. The recoveries were in the range of 87.3% to 98.3%, with the relative standard deviations in the range of 2.18%-5.21%. This method is accurate, simple and rapid, and can be used in rapid screening and quantitative analysis of the 11 illegally added antidiabetics in health care products.
Key words: ultra performance liquid chromatography (UPLC)     quadrupole/electrostatic field orbitrap high resolution mass spectrometry     antidiabetics     health care products    

糖尿病已被列为继心血管及肿瘤疾病之后的第三大疾病,降糖类保健品因其口感好、效果好、无不良反应、可以长期服用,受到部分糖尿病患者的青睐[1,2]。近年来保健品中非法添加化学降糖药物的现象屡禁不止,给社会及消费者带来了严重后果。若长期服用非法添加具有降血糖功能的化学药物(如二甲双胍、格列苯脲等)的保健品,不仅会带来各种毒副作用,甚至会致人死亡[3,4]。

目前检测化学降糖成分的方法主要有薄层色谱法[5,6]、高效液相色谱法[7,8,9]、液相色谱-质谱法[10,11]、毛细管电泳法[12]、离子选择性电极法[13]、气相色谱-质谱法[14]、拉曼光谱法[15]等。但保健食品基质复杂,导致这些检测方法存在前处理时间长、定量灵敏度低、定性准确性差等问题。

四极杆/静电场轨道阱高分辨质谱(Q Exactive)将四极杆质谱和静电场轨道阱高分辨质谱串联,具有质量分辨率高和能提供精确相对分子质量的功能,在全扫描模式下采集的数据可以根据检测需求反复调用,由此弥补传统低分辨质谱方法无法应对法规更新频繁的不足;数据依赖性扫描(data-dependent scan)可以在筛查的同时,通过碎片离子进行定性确证[12,13,14,15,16,17,18,19]。本文利用Q Exactive液相色谱-质谱联用系统,建立了降糖类保健品中11种非法添加的化学降糖药物的快速筛查方法,使用精确质量数及其二级质谱定性,较传统的检测方法大幅度提升了定性的准确性,降低了基质干扰的影响,同时该方法可以进行无标定性分析,方便快捷。

1 实验部分
1.1 仪器、试剂与样品

Q Exactive液相色谱-质谱联用系统(美国Thermo Fisher Scientific公司); Poroshell 120 SB-C18色谱柱(100 mm×4.6 mm,2.7 μ m,美国安捷伦公司),乙腈(色谱纯,美国Thermo Fisher Scientific公司);甲酸(色谱纯,美国Tedia公司);乙酸铵(美国Thermo Fisher Scientific公司);实验用水为去离子水。那格列奈、盐酸吡格列酮、格列喹酮、格列齐特、格列吡嗪、格列本脲、盐酸二甲双胍、瑞格列奈、盐酸苯乙双胍、盐酸罗格列酮、格列美脲等对照品均由中国药品生物制品检定所提供。

选择片剂、硬胶囊剂、颗粒剂3种类型具有降血糖功能的中药和保健品为研究对象,样品均为市场采购品。

1.2 样品的制备

取保健品片剂、胶囊或颗粒,精密称定,研细,精密称取5.0 g,置于50 mL烧杯中,加甲醇35 mL，超声处理20 min,冷至室温,转移至50 mL容量瓶中,加甲醇稀释至刻度,摇匀,过0.45 μ m滤膜,等待上机测定。

1.3 液相色谱条件

色谱柱:Agilent Poroshell 120 SB-C18(100 mm×4.6 mm,2.7 μ m)。流动相A: 10 mmol/L 乙酸铵水溶液;流动相B:乙腈。流速:0.3 mL/min。洗脱梯度:0～2 min,95%A～70%A; 2～7 min,70%A～50%A; 7～9 min,50%A～5%A; 9～12 min,5%A; 12～15 min,95%A。柱温:30 ℃。进样体积:10 μ L。

1.4 质谱条件

离子源:HESI(heated ESI)-II;喷雾电压:3800 V(正离子模式);气化温度:300 ℃;鞘气压(N2): 3.5×106 Pa;辅助气压(N2): 1×106 Pa;离子传输管管温度:320 ℃;扫描范围:m/z 100～900(分辨率(R): 70000);二级质谱:基于母离子列表的数据依赖采集(R: 17500),碰撞能量为50% 。

2 结果与讨论
2.1 色谱条件的优化
2.1.1 色谱柱的选择

本文分别采用1.7 μ m Waters BEH色谱柱和2.7 μ m Agilent Proshell C18色谱柱对11种化学降糖药物进行了色谱分离,结果显示:两种色谱柱均能很好地分离11种化合物,但在实际试验中,1.7 μ m填料的色谱柱工作压力较大,对上机样液的要求比较严格。日常检测中,保健品的样品前处理相对简单,其提取液杂质很容易导致色谱柱的堵塞。因此本实验采用2.7 μ m的色谱柱进行保健品中11种化合物的检测。

2.1.2 流动相的选择

本实验采用乙酸铵-乙腈为流动相。优化了乙酸铵溶液浓度,分别考察了5、10、20和50 mmol/L 乙酸铵与乙腈组成的流动相体系的分离效果。发现使用5 mmol/L 乙酸铵-乙腈时,11种化合物的分离效果不好,峰形较差;使用10、20和50 mmol/L 乙酸铵时质谱响应值理想,峰形很好。这主要是流动相的离子强度影响了目标物的分离和质谱响应,当离子浓度达到一定程度后,再增加离子浓度对目标物的分离和响应影响不大,且增加缓冲盐的浓度容易导致色谱堵塞和质谱污染,因此本实验采用10 mmol/L 乙酸铵-乙腈为流动相,通过优化试验,最终确定采用梯度洗脱。

2.2 质谱条件的优化
2.2.1 分辨率的选择

高分辨质谱通过提取一级质谱的精确质量数进行定性,因此选择合适的分辨率是准确定性的关键。分辨率为 17500、35000 和 70000 时在空白保健品中添加5.0 μ g/kg 格列齐特，比较提取离子色谱图。当分辨率为 17500、35000 和 70000 时,实测到格列齐特质荷比分别为 324.13542、324.13684 和 324.13718,与格列齐特的理论单一同位素质荷比 324.13764 相比其相对偏差(RD)分别为6.85×10-6、2.47×10-6和1.42×10-6;在分辨率为 70000 的条件下,目标物与干扰物质完全基线分离,有效地去除了基质干扰,提取离子色谱图清晰完整,可进行准确的定性和定量。因此选择一级质谱分辨率 70000 进行分析检测。

2.2.2 扫描方式的选择

在空白样品中添加11种化合物的标准溶液(50 mg/L),分别在正、负离子模式下考察了11种降糖类化合物的质谱响应。11种化合物均在正离子模式下有较强响应,因此选择在正离子模式下同时检测11种目标物质。

采用高分辨质谱的一级质谱全扫描加数据依赖的二级质谱扫描,设定目标物列表,在一级质谱扫描时发现列表中的母离子且其强度达到设定阈值时,对其进行二级扫描。通过实验可知二级质谱分辨率为 17500 时,即可满足定性要求。因此一级质谱采用 70000 的分辨率,二级质谱采用 17500 的分辨率进行数据采集,得到的谱图既有母离子的精确质量数,又有二级质谱全扫描信息,完全满足定性和定量要求。

2.3 快速筛查条件及谱库的建立
2.3.1 降糖化合物质谱图库的建立

利用上述的质谱条件,分别对11种化合物进行质谱数据采集,利用得到的质谱数据建立11种化合物的高分辨二级质谱图谱库。图1是11种降糖药物标准样品的二级质谱图。在实际样品分析中利用一级质谱的精确质量数和二级质谱图,可以实现在不使用标准品的情况下快速准确地对样品中目标物进行筛查和定性确认。

图1 11种降糖药物的二级质谱图 Fig.1 MS/MS spectra of the 11 antidiabetics a. nateglinid; b. pioglitazone; c. gliquidone; d. gliclazide; e. glipizide; f. glibencla; g. metformin hydrochloride; h. repaglinide; i. phenformin hydrochloride; j. rosiglitazone hydrochloride; k. glimepiride.
2.3.2 筛查方法的精密度和准确度

在空白样品中添加11种化合物的标准溶液(0.05 mg/L)作为样品进行测定。由表1可知,11种化合物的精确质量数的偏差在0.06×10-6～1.76×10-6之间,二级全扫描质谱图的匹配度在87.37%以上。

表1 11种降糖药的质量偏差和二级质谱匹配度 Table 1 Molecular mass deviations and MS/MS spectra matching degrees of the 11 antidiabetics

2.3.3 筛查方法的线性范围和检出限

本文分别利用片剂、胶囊和颗粒3种保健品基质空白溶液配制成含50 mg/L 的11种降糖化合物的溶液,利用11种降糖化合物的面积响应值,考察了3种空白基质对检测结果的影响。结果显示:11种化合物在3种空白基质中的面积响应值无明显变化。因此本试验选取较易处理的片剂空白基质考察11种降糖化合物的线性范围和检出限。

在空白保健品基质液中分别加入混合标准样品,配制质量浓度分别为0.005、0.010、0.050、0.100和0.500 mg/L 的基质加标溶液,以峰面积响应值Y为纵坐标,标准溶液质量浓度X(mg/L)为横坐标,外标法制作校准曲线。采用空白基质加标法制备阳性样品,11种降糖化合物的含量均为100 μ g/kg,平行测定6次,计算精密度。用基质提取液添加低水平的标准溶液,获得每种化合物对应信噪比等于3(S/N=3)时的含量,以此为该化合物的检出限。

由表2可知11种降糖类化合物的线性关系良好,线性回归系数均在0.99以上,各组分的检出限在2.7～5.1 μ g/kg 之间,重复进样的相对标准偏差在2.18% ～5.21%之间。在空白保健品基质中分别添加0.1、1和5 mg/kg 的标准品,测定11种降糖化合物的加标回收率,结果如表3所示。由表3可知:加标浓度为0.1 mg/kg 时,回收率在78.3% ～88.2%之间,RSD在5.27% ～9.24%之间;加标浓度为1 mg/kg 时,回收率在83.2% ～92.4%之间,RSD在3.29% ～6.39%之间;加标浓度为5 mg/kg 时,回收率在90.7% ～98.2%之间,RSD在2.17% ～4.44%之间。该方法完全适用于降糖类保健品中11种非法添加物的筛查及定量。

表2 11种降糖药的回归方程、相关系数、精密度和检出限 Table 2 Calibration curves,correlation coefficients (R2),precisions and limits of detection (LODs) of the 11 antidiabetics

表3 11种降糖化合物的加标回收率 Table 3 Spiked recoveries of the 11 antidiabetics
2.4 实际样品的检测

利用本方法分别对14种降糖类保健品进行了检测,共检出5份阳性样品,分别含有那格列奈、吡格列酮、格列齐特、格列吡嗪、格列本脲等化合物,其含量在200～1000 mg/kg 之间。图2和图3为阳性样品中那格列奈和吡格列酮的一级总离子流色谱图和二级质谱图。

图2 那格列奈的(a)总离子流色谱图和(b)二级质谱图 Fig.2 (a) Chromatogram of full scan and (b) MS/MS spectrum of nateglinide

图3 吡格列酮的(a)总离子流色谱图和(b)二级质谱图 Fig.3 (a) Chromatogram of full scan and (b) MS/MS spectrum of pioglitazone
3 结论

利用Q Exactive液相色谱-质谱联用系统建立了降糖类保健品中11种非法添加化学降糖药的快速筛查和定量分析方法。高分辨质谱的使用消除了复杂基质样品中的基质干扰,显著提高了定性和定量残留分析结果的准确性,数据依赖采集的二级质谱图提高了定性的准确性。本方法简便、可靠,应用于实际样品检测的重现性良好,能满足保健品中11种非法添加降糖药的快速筛查与定量分析。

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