首先制备GMAG,具体步骤如下:将1 mL GMA和0.2 mol/L 硫酸混合后置于50 ℃水浴中加热4 h,加入终浓度为10 mmol/L 的高碘酸钠,室温下避光放置1 h。将处理好的GMA逐滴加到溶解有0.4 g氢氧化钠和2 g氨基葡萄糖盐酸盐的20 mL甲醇中,同时加入10 mmol NaBH₃CN,搅拌直至溶液变为黄色透明液,减压蒸干至膏状,密闭充氮气后放置于4 ℃下保存。

然后制备pGMAG-SiO₂杂化填料,具体步骤如下:引发剂制备参照文献^{[15, 16]}中描述的步骤进行。在硅胶颗粒(粒径10 μ m,孔径20 nm)中加入1 mol/L 的盐酸(按1 g硅胶颗粒中加入10 mL 1 mol/L盐酸的比例),超声处理30 min,浸泡12 h后用去离子水洗涤数次,直至pH为中性。离心去除液体并将所得硅胶颗粒在80 ℃真空干燥箱中放置3 h。将处理后的硅胶与引发剂混合过夜,然后用甲醇清洗数次,加入ATRP反应液(0.01 mol/L CuCl,0.015 mol/L N,N,N′,N″,N″-五甲基二乙烯三胺,0.001 mol/L CuCl₂和2 mol/L GMAG),室温下反应24 h。聚合反应结束后,用甲醇清洗以去除未反应的反应物和其他杂质。将制备得到的pGMAG-SiO₂杂化填料在真空下干燥后备用。

标准糖蛋白:将0.1 mg OVA溶解于0.1 mL 50 mmol/L NH₄HCO₃溶液(pH 7.8)中,在95 ℃水浴中加热10 min,冷却后加入PNGase F酶(按0.1 mg蛋白质对应10 U酶的比例),于37 ℃下放置12 h,得到其N-糖链。

人血浆样品:将人血浆在4 ℃、16 000 g离心力下离心30 min除脂。然后使用50 mmol/L NH₄HCO₃溶液将其蛋白质的质量浓度稀释至1 mg/mL。余下操作同标准糖蛋白N-糖链的制备。

使用pGMAG-SiO₂填料自制固相萃取柱用于DP7寡糖和N-糖链的富集,主要操作步骤如下:称取1～2 mg pGMAG-SiO₂填料,用乙腈分散后装填于200 μ L的tip头中;将填充的小柱活化平衡好之后,将糖链用乙腈/水(80 ∶ 20,v/v)溶液溶解,慢慢注入小柱中;随后用100 μ L乙腈/水/甲酸(80 ∶ 20 ∶ 0.1,v/v/v)淋洗小柱3次以去除蛋白质和其他非极性物质;最后用乙腈/水/甲酸(10 ∶ 90 ∶ 0.1,v/v/v)洗脱剂洗脱糖链，并将洗脱液置于MALDI-TOF MS样品靶上,加入基质进行质谱分析。

首先，将单体GMA上的环氧基氧化为醛基,利用醛基和氨基葡萄糖上氨基的共价反应制备带有双键可用于ATRP反应的含糖单体GMAG。然后，合成SI-ATRP引发剂,该引发剂一端为ATRP引发剂,另一端为能与硅胶填料表面键合的硅烷偶联剂,可以利用硅烷偶联剂与硅胶填料表面的硅羟基共价连接,将SI-ATRP引发剂固定在硅胶颗粒表面。最后，以GMAG为单体,氯化亚铜为催化剂,N,N,N′,N″,N″-五甲基二乙烯三胺为配体,在硅胶颗粒表面引发ATRP反应原位生成葡萄糖聚合物链,制备新型核壳型亲水聚合物-硅胶杂化填料pGMAG-SiO₂。利用扫描电镜对聚合物修饰的硅胶颗粒和没有处理的硅胶颗粒进行表征。从图1中可以看出,未经修饰的硅胶颗粒表面比较光滑,经过聚合物修饰之后的颗粒表面粗糙度增加。证明通过SI-ATRP方法在硅胶颗粒表面成功修饰了亲水聚合物。

图1

Fig. 1

图1 (a)未经修饰的硅胶颗粒和(b)pGMAG-SiO2颗粒的扫描电镜图 Fig.1 SEM images of (a) bare silica particles and (b) pGMAG-SiO2 particles

pGMAG-SiO₂填料包含可热分解的聚合物层和不可热分解的硅胶颗粒两部分。从图2可看出,未经任何处理的硅胶填料在40～990 ℃温度范围内随热处理温度的提高无明显的质量损失;而经亲水聚合物修饰的硅胶杂化填料随热处理温度的提高,质量损失高达20% ,这是硅胶上的pGMAG聚合物热分解所导致的。这证明通过SI-ATRP法可以在硅胶填料表面原位聚合生成大量的亲水聚合物pGMAG。大量羟基的存在增强了pGMAG-SiO₂杂化填料的亲水性,从而提高了其对N-糖链的保留作用,有望对N-糖链有高效的富集。

图2

Fig. 2

图2 未经修饰的硅胶填料和pGMAG-SiO2杂化填料的热重分析图 Fig.2 Thermogravimetric analysis of bare silica microparticles and pGMAG-SiO2 packing

首先使用标准寡糖DP7评价了该亲水填料在微量糖链富集鉴定中应用的可能性。按照图3所示流程,将1 μ g DP7上样、淋洗、洗脱后进行MALDI-TOF MS鉴定。富集前DP7的质谱绝对信号强度为2.4×10⁴(m/z 1 175.0)(见图4a);使用乙腈/水/甲酸(80 ∶ 20 ∶ 0.1,v/v/v)淋洗之后,淋洗液在m/z 1 175 处只有极弱的质谱峰(见图4b);使用乙腈/水/甲酸(10 ∶ 90 ∶ 0.1,v/v/v)洗脱后,在m/z 1 175 处观测到较强的质谱峰信号(见图4c),且信号强度和富集前相差不多。这说明糖链可以在高比例的有机相条件下通过亲水相互作用保留在该亲水性硅胶杂化填料上,在高比例水相的条件下被洗脱,因此可以浓缩糖链样品提高质谱检测的信号强度。同时我们也考察了糖链在pGMAG-SiO₂填料上的回收率,通过测定不同浓度的DP7在m/z 1 175 处对应的质谱峰面积,建立标准曲线,使用外标法计算得到pGMAG-SiO₂杂化填料对DP7的回收率为91.2% ,说明pGMAG-SiO₂杂化填料对糖链具有较高的回收率。

图4

Fig. 4

图4 DP7经(a)pGMAG-SiO2杂化填料富集前、(b)淋洗液和(c)富集后的MALDI-TOF MS谱图 Fig.4 MALDI-TOF MS spectra of DP7 (a) before enrichment,(b) washing and (c) after enrichment by pGMAG-SiO2 packing

为了进一步评价pGMAG-SiO₂杂化填料在糖蛋白N-糖链富集检测中的应用,我们对标准糖蛋白上释放的N-糖链进行了富集检测。使用PNGase F释放OVA标准糖蛋白的N-糖链,经pGMAG-SiO₂杂化填料富集之后进行MALDI-TOF MS分析。从图5a可以看出,未经任何富集处理只能检测到14个糖链对应的质谱峰,且信号强度较弱,信噪比(S/N)较低。经过pGMAG-SiO₂杂化填料富集后可以
鉴定到21个糖链(对应的糖型结构见表1),与文献^[17]报道数量一致,并且信号强度较强,S/N较高(见图5b)。对于富集前、后均检测到的糖型信号,富集后的信号强度为富集之前的1～9.7倍(见表1)。以上数据证明了pGMAG-SiO₂杂化填料由于包裹了致密的葡萄糖聚合物层,具有较强的亲水性,对不同糖型的N-糖链均有良好的保留能力,适用于N-糖链的无偏性富集鉴定。

图5

Fig. 5

图5 OVA的N-糖链经pGMAG-SiO2(a)富集前和(b)富集后的MALDI-TOF MS谱图 Fig.5 MALDI-TOF MS spectra of N-glycans from OVA (a) before and (b) after enrichment by pGMAG-SiO2 packing The peak numbers are the same as in Table 1.

表1

Table 1

表1(Table 1)

表1 pGMAG-SiO2富集前、后质谱鉴定到的OVA的N-糖链的糖型 Table 1 Identified N-glycoforms of OVA before and after enrichment by pGMAG-SiO2

表1 pGMAG-SiO2富集前、后质谱鉴定到的OVA的N-糖链的糖型 Table 1 Identified N-glycoforms of OVA before and after enrichment by pGMAG-SiO2

已经有文献报道,人血浆中糖蛋白的糖型结构改变和多种癌症的发生有密切关系,例如乳腺癌、前列腺癌及肝癌等^{[18, 19, 20]}。因此鉴定人血浆中糖蛋白的N-糖链结构有利于发现多种癌症诊断生物标志物,为这些疾病的临床研究及药物研发提供有价值的数据。对血浆糖蛋白经PNGase F酶解释放的N-糖链直接进行MALDI-TOF MS检测，只能鉴定到11种糖型,并且信号强度较差,S/N较低(见图6a)。使用本文制备的新型核壳型pGMAG-SiO₂杂化填料富集后,可以鉴定到47种糖型(见图6b),包含了N-糖链的3种糖型构型(高甘露糖型、复合型和杂合型),比文献报道的42种糖型有所增加^[21]。而且信号强度和S/N也得到显著改善,例如,MALDI-TOF MS谱图中的m/z 1 647.7 质谱峰对应的是IgG释放的N-糖链Hex₄HexNAc₄Fuc₁,经过该亲水填料富集之后S/N提高了16倍。N-糖链质谱信号和信噪比的提高得益于该亲水杂化填料能够有效浓缩富集N-糖链,且在富集的同时又能够有效去除血浆样品中的非极性杂质(如蛋白质及多肽等),降低了其对N-糖链质谱信号的抑制。以上结果进一步说明了该亲水杂化填料可以用于复杂生物样本中N-糖链的高效且无偏性富集。

图6

Fig. 6

图6 人血浆糖蛋白N-糖链经pGMAG-SiO2(a)富集前和(b)富集后的MALDI-TOF MS谱图 Fig.6 MALDI-TOF MS spectra of N-glycans from human plasma proteins (a) before and (b) after enrichment by pGMAG-SiO2 packing/span>