色谱  2015, Vol. 33 Issue (3): 235-241   PDF (1077 KB)    
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林涛
邵金良
刘兴勇
杨东顺
陈兴连
李彦刚
樊建麟
刘宏程
QuEChERS-超高效液相色谱-串联质谱法测定蔬菜中41种农药残留
林涛1,2, 邵金良1, 刘兴勇1, 杨东顺1, 陈兴连1, 李彦刚1, 樊建麟1, 刘宏程1,2     
1. 云南省农业科学院质量标准与检测技术研究所, 云南 昆明 650223;
2. 农业部农产品质量安全风险评估实验室(昆明), 云南 昆明 650223
收稿日期：2014-11-17
基金项目：2014年国家蔬菜产品质量安全风险评估项目(GJFP2014001);云南省社会发展科技计划项目(2012CA005).
通讯作者：刘宏程,E-mail:liuorg@163.com
摘要：采用QuEChERS-超高效液相色谱-串联质谱技术,建立了蔬菜中常见的隐性农药、禁限用农药、植物生长调节剂等检出率较高的41种农药残留的测定方法。蔬菜样品用1%(v/v)乙酸-乙腈溶液提取,乙二胺-N-丙基硅烷(PSA)净化后直接进样分析,采用正、负离子多反应监测(MRM)模式,外标法定量。结果表明,在优化后的QuEChERS、色谱和质谱条件下,41种农药在1.0~100 μg/L范围内线性关系良好,相关系数(r2)大于0.999,检出限为0.003~1.00 μg/kg,不同基质中的平均回收率范围为74.1%~120.4%,相对标准偏差(RSD)范围为2.8%~11.9%。该方法快速简便、灵敏度高、净化效果好,可用于蔬菜中41种农药的快速测定,为蔬菜质量安全风险评估工作提供了有力保障。
关键词： QuEChERS     超高效液相色谱-串联质谱     农药     蔬菜     残留    
Determination of 41 pesticide residues in vegetables by QuEChERS-ultra performance liquid chromatography- tandem mass spectrometry
LIN Tao1,2, SHAO Jinliang1, LIU Xingyong1, YANG Dongshun1, CHEN Xinglian1, LI Yangang1, FAN Jianlin1, LIU Hongcheng1,2     
1. Institute of Agriculture Quality Standards & Testing Technique, Yunnan Academy of Agricultural Science, Kunming 650223, China;
2. Laboratory of Quality & Safety Risk Assessment for Agro-Products (Kunming), Ministry of Agriculture, Kunming 650223, China
Received: 2014-11-17
Abstract: A multiresidue analytical method for the rapid determination of 41 pesticide residues in vegetables was developed by using QuEChERS-ultra performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry (UPLC-MS/MS), including recessive pesticides, banned pesticides and pesticides with restrict use, plant growth regulators and some other pesticides with high detection rates. The vegetable sample was extracted by 1% (v/v) acetic acid-acetonitrile, cleaned-up by primary secondary amine (PSA) and injected for analysis. The positive and negative ion modes and multiple reaction monitoring (MRM) mode were used in the analysis, and the analytes were quantified by the external standard method. Under the conditions of optimized QuEChERS, chromatography and mass spectrometry, the 41 pesticides showed good linearities in the range of 1.0 μg/L to 100 μg/L, with the correlation coefficients (r2) higher than 0.999. The limits of detection of the method were 0.003 μg/kg to 1.00 μg/kg. The average recoveries of the 41 pesticides in different matrices were in the range of 74.1%-120.4% with the relative standard deviations from 2.8% to 11. 9%. The method has the advantages of rapidity, simplicity, high sensitivity and better purification effect. It is suitable for the rapid determination of the common pesticides in vegetables, and it provides a strong guarantee for the risk assessment of the quality and safety of vegetables.
Key words: QuEChERS     ultra performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry (UPLC-MS/MS)     pesticides     vegetable     residues    

随着我国人口的不断增长,蔬菜的消耗量不断增加。为了提高产量,过量使用农药甚至使用禁限用农药的现象时有发生。过量使用的农药不仅会在蔬菜中残留从而对生物体产生危害,而且对环境也会造成很大的污染[1, 2]。

蔬菜生产中常用的农药主要包括杀虫剂、杀菌剂和植物生长调节剂等。近年来检出率较高的农药主要包括涕灭威、涕灭威砜、涕灭威亚砜、克百威、3-羟基克百威、丁硫克百威等氨基甲酸酯类农药;氯虫苯甲酰胺、氟虫双酰胺、吡虫啉、啶虫脒和噻虫嗪等杀虫剂;多菌灵、嘧菌酯、腈菌唑、吡唑醚菌酯等杀菌剂;氯吡脲和多效唑等植物生长调节剂;以及现在广泛使用的生物来源的农药,如多杀霉素和除虫菊素等。目前,这些常见农药残留的检测方法主要包括气相色谱[3, 4]、液相色谱[5, 6]、液相色谱-质谱联用[7, 8]、气相色谱-质谱联用[9, 10]等。但是这些方法的适用范围小,对于复杂基质中的农药残留测定干扰较大。随着样品前处理技术的不断创新和检测仪器的飞速进步,QuEChERS-超高效液相色谱-串联质谱法因其前处理快速便捷、分析速度快、抗干扰能力强、灵敏度高而广泛应用于蔬菜中农药的多残留分析[11, 12, 13]。

针对目前蔬菜中禁限用农药时有检出的现象,同时为了对蔬菜中农药的使用情况进行调查,加强我国农产品的质量安全监管,科学指导蔬菜安全生产,建立蔬菜中隐性农药、禁限用农药(涕灭威、涕灭威砜、涕灭威亚砜、克百威、三羟基克百威、氧乐果等)及植物生长调节剂(2,4-二氯苯氧乙酸、矮壮素、氯吡脲、多效唑等)等农药的测定方法意义重大。

本研究根据我国2014年农产品质量安全风险评估的要求以及本地的农药实际使用情况,利用QuEChERS-超高效液相色谱-串联质谱法,建立了快速测定蔬菜中常见的隐性农药、禁限用农药、植物生长调节剂以及其他检出率较高的杀虫剂和杀菌剂等41种农药残留的方法,为蔬菜质量安全风险评估工作提供了更为简便、灵敏、可靠的分析方法。

1 实验部分
1.1 主要仪器与装置

API 4000三重四极杆质谱仪,美国AB公司;1290 超高效液相色谱仪,美国Agilent公司;ZORBAX RRHD色谱柱(50 mm×2.1 mm,1.8 μ m),美国Agilent公司;AE100电子分析天平,瑞士METTLER TOLEDO公司;HY-5回旋式振荡仪,江苏省金坛市环宇科学仪器厂;TGL-15B高速台式离心机,上海安亭科学仪器厂;涡旋振荡器,美国Thermo Scientific公司。

1.2 主要材料与试剂

甲醇、乙腈(色谱纯),德国Merck公司;无水MgSO4、NaCl、乙酸铵(分析纯),上海国药集团;乙酸、甲酸(色谱纯),美国Fluka公司;乙二胺-N-丙基硅烷(PSA)(40 μ m),美国Varian公司;纯净水,杭州娃哈哈公司;氧乐果(omethoate)、涕灭威亚砜(aldicarb-sulfoxide)、涕灭威砜(aldicarb-sulfone)、多菌灵(carbendazim)、灭幼脲(chlorbenzuron)、吡虫啉(imidacloprid)、啶虫脒(acetamiprid)、3-羟基克百威(3-hydroxycarbofuran)、涕灭威(aldicarb)、氟啶脲(chlorfluazuron)、克百威(carbofuran)、氯吡脲(forchlorfenuron)、嘧菌酯(azoxystrobin)、烯酰吗啉(dimethomorph)、腈菌唑(myclobutanil)、咪鲜胺(prochloraz)、辛硫磷(phoxim)、甲氨基阿维菌素苯甲酸盐(emamectin benzoate)、阿维菌素(avermectin)、丁硫克百威(carbosulfan)、二甲戊乐灵(pendimethalin): 1 000 mg/L,农业部环境保护科研检测所;灭蝇胺(cyromazine)、氟虫双酰胺(flubendiamide)、噻虫嗪(thiamethoxam)、2,4-二氯苯氧乙酸(2,4-D)、氟吗啉(flumorph)、莠去津(atrazine)、氯虫苯甲酰胺(chlorantraniliprole)、咯菌腈(fludioxonil)、多效唑(paclobutrazol)、氰霜唑(cyazofamid)、多杀霉素A(spinosad A)、多杀霉素D(spinosad D)、鱼藤酮(rotenone)、虫酰肼(tebufenozide)、醚菌酯(kresoxim-methyl)、噻嗪酮(buprofezin)、茚虫威(indoxacarb)、除虫菊素Ⅰ(pyrethrins Ⅰ)、除虫菊素Ⅱ(pyrethrins Ⅱ):分析标准品,纯度≥96.0% ,美国Sigma公司;吡唑醚菌酯(pyraclostrobin):分析标准品,纯度≥97.0% ,中国百灵威科技公司。

1.3 实验方法
1.3.1 标准溶液的配制

取适量的标准物质,用甲醇稀释成40 mg/L 的标准储备液。准确吸取一定体积的各农药标准储备液,用甲醇定容,得到41种农药的混合标准溶液,-20 ℃下避光保存。

1.3.2 样品的处理

称取5.00 g蔬菜样品于50 mL离心管中,再加入10.0 mL含1%(v/v)乙酸的乙腈溶液、600 mg无水MgSO4和1.0 g NaCl,振荡提取10 min,在 5 000 r/min 下离心5 min，取上清液5 mL于预先加入80 mg PSA填料的离心管中,涡旋提取15 s,在 5 000 r/min 下离心5 min,取上层提取液1.0 mL过0.22 μ m滤膜,待分析。

1.3.3 色谱条件

流动相A为1 mmol/L 乙酸铵水溶液(含0.1%(v/v)甲酸),流动相B为甲醇。梯度洗脱条件:0～8.00 min,95%A～10%A; 8.00～11.00 min,10%A; 11.00～11.10 min,10%A～95%A; 11.10～12.50 min,95%A。流速:0.2 mL/min;柱温:35 ℃;进样量:1 μ L。

1.3.4 质谱条件

离子源:ESI源;扫描方式:正离子和负离子同时扫描;气帘气流速:20 L/min;雾化气流速:55 L/min;辅助气流速:55 L/min;辅助加热气温度:550 ℃;喷雾电压:5 500 V/-5 500 V;采用多反应监测(MRM)模式。

2 结果与讨论
2.1 QuEChERS方法的优化
2.1.1 提取溶剂的选择

目前蔬菜中农药的提取溶剂大多采用甲醇或乙腈,以及酸性的甲醇或乙腈等。本研究以白菜为试验对象,以10 μ g/kg 为加标浓度,分别比较了甲醇、乙腈、1%(v/v)甲酸-甲醇溶液、1%(v/v)乙酸-甲醇溶液、1%(v/v)甲酸-乙腈溶液和1%(v/v)乙酸-乙腈溶液对于目标农药的提取效率。实验结果表明,甲醇和酸性甲醇的提取效率较差,可能是在甲醇-水溶液体系中,甲醇与水极易互溶,增大了共提取物的含量,从而降低了甲醇对农药的提取效率;而乙腈-水溶液体系中,盐的加入能够明显促进乙腈与水的分层,从而提高了乙腈的提取效率。另外,甲酸的酸性较强,pH较低不利于一些农药的提取;而乙酸的酸性比甲酸弱,1%(v/v)乙酸-乙腈溶液具有较好的提取效果,41种农药的平均回收率为96.1% 。因此采用1%(v/v)乙酸-乙腈溶液作为提取溶剂。

2.1.2 无水MgSO4加入量的选择

以白菜为试验对象,以10 μ g/kg 为加标浓度,分别比较了添加200、400、600、800和 1 000 mg无水MgSO4的回收效果。结果表明,当无水MgSO4的加入量为600 mg时达到最大的回收率(87.5% );当无水MgSO4的加入量为200和400 mg时,回收率较低,加入量不够,不能促进农药完全溶解于有机相中;而加入量为800和 1 000 mg时,过量的MgSO4可能会吸附目标农药,从而降低了提取效率。故采用无水MgSO4的添加量为600 mg。

2.1.3 PSA加入量的选择

PSA的加入量对于QuEChERS方法的最终结果影响较大。本研究在上述优化结果的基础上,以白菜为试验对象,以10 μ g/kg 为加标浓度,分别比较了添加40、60、80和100 mg PSA的回收效果。结果表明,当添加量为40 mg时,41种农药的平均回收率较低,为63.4% ;当添加量为60 mg时,41种农药的平均回收率为120.0% ,且部分农药的回收率已超过了140% ,如涕灭威、涕灭威砜、涕灭威亚砜、克百威、3-羟基克百威、丁硫克百威、茚虫威等氨基甲酸酯类农药,分析发现这类农药中都含有-N-COO-基团,可能在PSA的加入后存在一定的基质增强效应,但其机制还有待于进一步的分析;当添加量为100 mg时,41种农药的平均回收率为136.6% ,与加入60 mg PSA的情况类似,部分农药的回收率也异常升高,如氯虫苯甲酰胺和氟虫双酰胺等邻甲酰胺基苯甲酰胺类农药,以及吡虫啉、啶虫脒和噻虫嗪等烟碱类农药,不符合农残分析中回收率的要求;而当添加量为80 mg时的平均回收率为106.3% ,符合正常的回收率要求。因此最终选择PSA的添加量为80 mg。

2.2 质谱和色谱条件的优化
2.2.1 质谱条件的优化

分别将41种农药标准储备溶液稀释至0.1 mg/L,利用针泵进样,分别进行一级质谱扫描以确定各农药的准分子离子峰,并优化其解簇电压(DP)和入口电压(EP);再分别以其准分子离子进行二级质谱扫描,优化其碰撞能量(CE)和碰撞室出口电压(CXP),根据各农药的响应情况确定定量与定性离子,相关参数见表1。

表1 41种农药的相关质谱参数 Table 1 MS parameters of the 41 pesticides
2.2.2 色谱条件的优化

本实验中以41种农药的混合标准溶液(0.05 mg/L)进样,分别比较了甲醇-水、甲醇-0.1%(v/v)乙酸水溶液,甲醇-0.1%(v/v)甲酸水溶液和甲醇-0.1%(v/v)甲酸水溶液(含1 mmol/L 乙酸铵)4种流动相对于各种农药的色谱峰峰形和响应值的影 响。实验结果表明,咯菌腈、除虫菊素Ⅰ、除虫菊素Ⅱ、多杀霉素A、多杀霉素D、甲氨基阿维菌素苯甲酸盐等农药的色谱峰峰形和响应值受流动相的影响较大。因此,本研究重点对这几种农药进行流动相条件的优化,以下分别以咯菌腈、除虫菊素Ⅰ、多杀霉素D为例,比较了不同流动相的影响。

由图1可知,咯菌腈在甲醇-0.1%(v/v)乙酸水溶液作为流动相时的响应最差;而流动相中加入甲酸后其响应增强;但是在甲醇-0.1%(v/v)甲酸水溶液中加入一定量的乙酸铵时,其响应明显增强,提示乙酸铵的加入可以抑制咯菌腈[M+Na]+峰的形成,而促进[M+NH4]+峰的形成,并以[M+NH4]+作为母离子可以得到较强的子离子碎片,因此可以增强咯菌腈的响应值。

图1 咯菌腈在不同流动相中的色谱图 Fig.1 Chromatograms of fludioxonil in different mobile phases Green peak: methanol-0.1% (v/v) formic acid aqueous solution; red peak: methanol-0.1% (v/v) acetic acid aqueous solution; blue peak: methanol-water; grey peak: methanol-0.1% (v/v) formic acid aqueous solution (containing 1 mmol/L ammonium acetate).

由图2可知,除虫菊素Ⅰ在以甲醇-0.1%(v/v)乙酸水溶液作为流动相时的响应也较差;而在甲醇-0.1%(v/v)甲酸水溶液(含1 mmol/L 乙酸铵)为流动相时的响应较好,说明乙酸铵的加入可以抑制除虫菊素Ⅰ[M+Na]+峰的形成,而促进[M+H]+峰的形成,并以[M+H]+作为母离子可以得到较强的子离子碎片,从而提高其响应值。

图2 除虫菊素Ⅰ在不同流动相中的色谱图 Fig.2 Chromatograms of pyrethrin Ⅰ in different mobile phases Green peak: methanol-0.1% (v/v) formic acid aqueous solution; red peak: methanol-0.1% (v/v) acetic acid aqueous solution; blue peak: methanol-water; grey peak: methanol-0.1% (v/v) formic acid aqueous solution (containing 1 mmol/L ammonium acetate).

由图3可知,多杀霉素D在以甲醇-水溶液作为流动相时的峰形也较差;但是在甲醇-0.1%(v/v)乙酸水溶液和甲醇-0.1%甲酸水溶液为流动相时的峰形较好,且基线噪声较小;而在甲醇-0.1%(v/v)甲酸水溶液中加入了乙酸铵可以增大其响应值。同时除虫菊素Ⅱ和甲氨基阿维菌素苯甲酸盐在本研究中也出现了相同的现象。因此,对于部分农药的串联质谱分析,适量加入甲酸和乙酸铵可以抑制[M+Na]+峰的形成,促进[M+H]+或[M+NH4]+峰的形成,能够一定程度地改变色谱峰形并增强其响应值,从而提高检测的灵敏度。

图3 多杀霉素D在不同流动相中的色谱图 Fig.3 Chromatograms of spinosad D in different mobile phases Green peak: methanol-0.1% (v/v) formic acid aqueous solution; red peak: methanol-0.1% (v/v) acetic acid aqueous solution; blue peak: methanol-water; grey peak: methanol-0.1% (v/v) formic acid aqueous solution (containing 1 mmol/L ammonium acetate).

综合以上不同农药在不同流动相中的峰形和响应情况,最终确定以甲醇-0.1%(v/v)甲酸水溶液(含1 mmol/L 乙酸铵)作为流动相。在该流动相条件下,41种农药的峰形较好,响应值较高,其总离子流色谱图如图4所示。

图4 41种农药混合标准溶液在MRM模式下的总离子流色谱图(0.05 mg/L) Fig.4 Total ion chromatograms of the mixed standard solution of the 41 pesticides (0.05 mg/L)
2.3 线性范围和检出限

将41种农药标准溶液稀释成不同的浓度,以峰面积对各种农药的浓度进行线性回归。同时通过白菜空白基质进行检出限和定量限的考察,分别以3倍和10倍信噪比(S/N)来确定其检出限和定量限。如表2所示,41种农药的相关系数(r2)较好,且检出限较低,能够满足蔬菜中农药残留的测定要求。

表2 41种农药的线性范围、相关系数(r2)、检出限和定量限 Table 2 Linear ranges,correlation coefficients (r2),limits of detection (LODs) and limits of quantitation (LOQs) of the 41 of pesticides
2.4 回收率和精密度

在质谱分析中,基质效应经常出现。因此在进 行回收试验时,根据不同的实验对象,分别采用其空白基质提取液进行标准溶液的配制。本试验中分别以白菜、生菜和番茄作为试验对象,并分别根据各农药的定量限,以5倍定量限作为添加浓度进行回收试验,每个试验对象做6次平行试验并计算其平均回收率。由表3可知,41种农药的平均回收率范围为74.1% ～120.4% ,相对标准偏差范围为2.8% ～11.9% ,通过基质加标的方式可以有效地抑制基质效应,实验结果满足多残留测定的要求。

表3 41种农药的回收率和相对标准偏差(n=6) Table 3 Recoveries and relative standard deviations of the 41 pesticides (n=6)
3 结论

本文建立了QuEChERS-超高效液相色谱-串联质谱准确测定蔬菜中41种农药残留的方法。采用MRM监测模式,外标法定量,能够同时完成蔬菜中41种常见农药的定性和定量分析,准确度和精确度较好。该方法快速简单、灵敏度高、净化效果好,适合蔬菜中41种农药残留的快速分析。

参考文献
[1]Chen C, Qian Y, Chen Q, et al. Food Control, 2011, 22(7): 1114  
[2]Naik S, Prasad R. J Chem Health Saf, 2006, 13(6): 12  
[3]Hu Y Q, Xi C X, Cao S R, et al. Chinese Journal of Chromatography (胡业琴, 郗存显, 曹淑瑞, 等. 色谱), 2014, 32(7): 784
[4]Colume A, Cardenas S, Gallego M, et al. Anal Chim Acta, 2001, 436(1): 153  
[5]Hou R Y, Bian H Z, Zhao X X, et al. Journal of Instrumental Analysis (侯如燕, 卞红正, 赵秀霞, 等. 分析测试学报), 2011, 30(1): 58
[6]Melo A, Aguiar A, Mansilha C, et al. Food Chem, 2012, 130(4): 1090  
[7]Guo C J, Li N, Wang J Z. Journal of Chinese Mass Spectrometry Society (郭春景, 李娜, 王建忠. 质谱学报), 2014, 35(3): 279
[8]Liu H, Xu J Z, Ding T, et al. Journal of Instrumental Analysis (柳菡, 徐锦忠, 丁涛, 等. 分析测试学报), 2009, 28(2): 181
[9]Ge N, Liu X M, Li X M, et al. Journal of Instrumental Analysis (葛娜, 刘晓茂, 李学民, 等. 分析测试学报), 2012, 30(12): 1351
[10]Chen H P, Liu X, Wang Q H, et al. Journal of Chinese Mass Spectrometry Society (陈红平, 刘新, 汪庆华, 等. 质谱学报), 2010, 31(4): 220
[11]Huang H H, Zhang J, Xu D M, et al. Chinese Journal of Chromatography (黄何何, 张缙, 徐敦明, 等. 色谱), 2014, 32(7): 707
[12]Wang F, Li T, Ma C. Chinese Journal of Chromatography (王菲, 李彤, 马辰. 色谱), 2013, 31(3): 191  
[13]Zhao H H, Xu J, Dong F S, et al. Anal Methods, 2014, 6(12): 4336