羧甲基- β -环糊精(阿拉丁试剂上海有限公司);甲苯(分析纯,中国医药集团上海化学试剂有限公司);二甲基十八烷基氯硅烷(日本TCI公司);甲醇和乙腈(色谱纯,Tedia公司);丙酮(分析纯,上海凌峰化学试剂有限公司);盐酸安非他酮(批号100671-200301)、盐酸克伦特罗(批号100072-200402)、盐酸艾司洛尔(批号100749-200501)、酒石酸美托洛尔(批号100084-201102)均购于中国食品药品检定研究院;熔融石英毛细管(100 μ m i.d.,河北永年锐沣色谱器件有限公司)。

TriSep-2100加压毛细管电色谱仪(美国Unimicro Technologies公司),包括柱上紫外检测器、微流控系统、溶剂输送系统、高压电源和数据采集系统;场发射扫描电镜(日本Hitachi公司); DF-101S集热式恒温加热磁力搅拌器(巩义市予华仪器有限责任公司); KQ2200B型超声波清洗器(昆山超声仪器有限公司); 10 μ L微量进样器(上海佳安分析仪器厂); JD200-3电子天平(郑州南北仪器有限公司); XW-80涡旋混合器(上海青浦沪西仪器厂); Eppendorf移液器购自北京泰亚赛福科技发展有限责任公司; Milli-Q Integral纯水-超纯水一体化系统(美国Millipore公司)。

色谱柱:自制的C18毛细管柱,规格:100 mm (总长400 mm)×100 μ m i.d.;施加电压:2 kV,进口端接地,出口端施加负电,电渗流方向与压力流方向一致;加压毛细管电色谱系统中分流管规格:2 m×50 μ m i.d.。分离手性药物时分流比约为300 ∶ 1,定量进样环体积为1 μ L,实际进样量约为3.3 nL;流动相:乙腈-5 mmol/L 乙酸铵缓冲液(20/80,v/v),pH 4.0,含手性流动相添加剂羧甲基 β -环糊精(CM- β -CD)15 mmol/L。

精密称取样品盐酸安非他酮，溶解在甲醇中配成1 g/L 的储备液,0.45 μ m微孔滤膜过滤,于4 ℃冰箱中保存,使用前稀释至所需浓度。精密称取盐酸克伦特罗、酒石酸美托洛尔、盐酸艾司洛尔，溶解在超纯水中配成1 g/L 的储备液，0.45 μ m微孔滤膜过滤,于4 ℃冰箱中保存,使用前稀释至所需浓度。

参考文献^[13],采用改良的Stber法制备了1 μ m无孔二氧化硅微球,BET法测试比表面积为15 m²/g,孔径＜2 nm。电镜扫描图(图1a)显示该微球粒径均一，表面光滑，颗粒单分散性良好。

图1

Fig. 1

图1 颗粒的扫描电镜图 Fig.1 Scanning electron microscope (SEM) micrographs of particles a. 1 μ m SiO2 particles; b. cross-section of 1 μ m C18 column after 400 times of sample injection.

在C18固定相的合成中,硅球上裸露的羟基与二甲基十八烷基氯硅烷上的活性氯反应,从而将基团键合在硅球表面。由于硅球表面羟基较多,单次硅烷化并不能完全将羟基覆盖。为了提高键合量,我们将制备得到的固定相进行了二次硅烷化,即将所得的固定相以相同的条件再次硅烷化,使硅球表面剩余的羟基尽可能多地被修饰。

该硅球特殊的无孔结构使其与常规全多孔填料相比有更好的耐压性。图1b为进样400次后1 μ m无孔硅胶毛细管柱横截面的电镜表征图,可以看出,微米无孔二氧化硅毛细管色谱柱在长时间使用后,颗粒形态仍为规整均匀的球形,且未出现明显的破损,该毛细管柱进样400次所承受的压力范围为13～18 MPa。因此,在使用较高压力的色谱分离系统中,无孔二氧化硅颗粒的机械强度好,抗压能力强,使命寿命长。

红外表征:合成的C18固定相Ⅱ的红外光谱上出现了 2 927 cm^-1和 2 865 cm^-1的吸收峰,为骨架和间隔臂上的亚甲基的伸缩振动谱带。红外光谱图中也出现了 1 450 cm^-1的吸收峰,为碳氢的伸缩振动峰,表明固定相表面成功键合上了C18。

元素分析:对单次硅烷化的固定相Ⅰ和重复硅烷化后的固定相Ⅱ做了元素分析,并根据文献^[15]公式计算出键合量(见表1),单次硅烷化的键合量为0.64 μ mol/m²,二次硅烷化的键合量为1.02 μ mol/m²。从结果可以看出,二次硅烷化和单次硅烷化相比,固定相碳含量有明显的提升。二次硅烷化方法适用于小颗粒硅球的官能团修饰,能显著提高固定相键合量。

表1

Table 1

表1(Table 1)

表1 两种C18固定相的元素分析 Table 1 Elemental analysis of C18 stationary phase Stationary phase Elemental content/% C18 coverage/ (μmol/m2) C H N Ⅰ 3.26 1.69 ＜0.2 0.64 Ⅱ 5.22 1.86 ＜0.2 1.02

表1 两种C18固定相的元素分析 Table 1 Elemental analysis of C18 stationary phase

在手性流动相添加剂法中,色谱柱良好的色谱性能对手性分离结果至关重要。保证色谱柱的良好性能是保证分离效果的前提。本文在毛细管液相色谱(capillary liquid chromatography,cLC)模式下,选择了5种苯系物即:苯、甲苯、乙苯、丙苯及正丁苯为溶质探针,考察了该微米固定相的色谱性能。从图2可以看出,5种苯系物在15 min内得到了分离。出峰顺序依次是苯、甲苯、乙苯、丙苯、正丁苯。疏水性最强的正丁苯最后出峰,该色谱固定相表现出典型的反相色谱性能。各峰的柱效分别为 150 000、150 000、170 000、190 000、190 000 理论塔板数/m,此时的线性流速约为0.6 mm/s,体现了小粒径填料的柱效优势。自制的毛细管C18色谱柱色谱性能良好,可以用于进一步的手性分离分析。

图2

Fig. 2

图2 苯系物在1 μ m C18色谱柱上的分离色谱图 Fig.2 Chromatogram of benzene series on 1 μ m C18 column cLC mode; column dimension: 100 mm (total length 400 mm)×100 μ m i.d.; mobile phase: ACN/H2O (75/25,v/v); pump flow rate: 0.07 mL/min; split ratio: 500 ∶ 1. Peak identifications: 1. benzene; 2. toluene; 3. ethylbenzene; 4. phenylpropane; 5. n-butyl benzene.

在cLC模式下,固定其他条件,考察了不同浓度的羧甲基- β -环糊精对分离度的影响。从表2可以看出,随着手性添加剂浓度的增加,分离度逐渐增加,当增加至15 mmol/L 时,分离度达到最大值,继续增加CM- β -CD浓度,分离度基本无变化,且样品的保留时间有一定程度的增加。考虑到后续的加电测试,本文选择了15 mmol/L CM- β -CD。

表2

Table 2

表2(Table 2)

表2 羧甲基环糊精的浓度及乙腈体积分数对分离度的影响 Table 2 Effects of CM- β -CD concentration and ACN volume fraction on resolution Compound Rs CM-β-CD concentrations/(mmol/L) φ(ACN)/% 5 10 15 20 10 20 30 50 70 90 Bupropion hydrochloride 0 0.90 1.42 1.43 1.38 1.43 1.22 0.63 0 0 Clenbuterol hydrochloride 0.90 1.90 2.65 2.65 2.62 2.65 1.70 0.92 0.55 0 Metoprolol tartrate 0 0.70 1.24 1.23 1.22 1.24 0.83 0.51 0 0 Esmolol hydrochloride 0.61 1.00 1.39 1.42 1.38 1.39 1.01 0.70 0 0

表2 羧甲基环糊精的浓度及乙腈体积分数对分离度的影响 Table 2 Effects of CM- β -CD concentration and ACN volume fraction on resolution

随着乙腈含量的增加,4种碱性药物分离度先微弱增加,后逐渐降低。其中乙腈浓度越小,流动相的洗脱能力越弱,峰形越差。而随着乙腈浓度的增加,有机溶剂会与溶质分子相互竞争占据环糊精内腔,环糊精的包和能力降低,分离度下降。盐酸安非他酮、盐酸克伦特罗、酒石酸美托洛尔、盐酸艾司洛尔对映体的分离度在20%(v/v)乙腈时达到最大，具体结果见表2。

本研究使用乙酸铵作为缓冲盐,考察了乙酸铵缓冲液的pH (pH 3.0到8.0)和缓冲盐浓度对分离度的影响。固定其他条件,4种药物在pH 4.0时分离度最大。同样,考察缓冲盐的浓度,结果显示,乙酸铵浓度从0 mmol/L 升高至5 mmol/L 时,分离度逐渐增加；而乙酸铵浓度从5 mmol/L 升高至10 mmol/L 时,分离度变化不大；乙酸铵浓度大于10 mmol/L 时,随着乙酸铵浓度的增加,峰形逐渐变宽,且分离度变小。可能的原因是乙酸铵能够与溶质相互竞争占据环糊精内腔。考虑到后续实验的加电测试,我们选择了缓冲盐浓度为5 mmol/L 作为最佳浓度。

毛细管柱的进口端接零极,出口端接负极,施加负电,此时电渗流方向与压力流方向一致,随着电压的增加,样品的保留时间减小。未施加电压时,即在毛细管液相色谱模式下,我们设定的流速为0.05 mL/min。

施加电压时,将流速降低至0.03 mL/min。随着电压的升高,4种药物的分离度都有一定程度的改善,2 kV时药物呈现最大的分离度;继续增加电压,分离度又呈下降趋势。这可能是施加电压为0 kV (cLC模式)时,驱动力为压力流呈抛物线模型；而在电压逐渐升高的过程中(pCEC模式),我们一方面降低了抛物线模型的压力流,同时又增加了塞子模型的电渗流,2 kV时两者有最好的结合点,分离度达到最大值;随着电压的继续升高,由于电渗流继续增加,样品和固定相的作用时间减少,造成分离度下降;结果如图3所示。图4为盐酸安非他酮在不同电压下的分离色谱图,0 kV时未达到基线分离,2 kV时分离度最高,达到基线分离。另外3种药物盐酸克伦特罗、酒石酸美托洛尔及盐酸艾司洛尔也呈现出相同的分离趋势。

图3

Fig. 3

图3 施加电压对4种对映体分离度的影响 Fig.3 Effect of applied voltage on resolutions of the four enantiomers cLC mode; column dimension: 100 mm (total length 400 mm)×100 μ m i.d.; mobile phase: ACN/H2O (75/25,v/v); pump flow rate: 0.07 mL/min; split ratio: 500 ∶ 1. Peak identifications: 1. benzene; 2. toluene; 3. ethylbenzene; 4. phenylpropane; 5. n-butyl benzene.

图4

Fig. 4

图4 苯系物在1 μ m C18色谱柱上的分离色谱图 Fig.4 Chromatogram of benzene series on 1 μ m C18 column pCEC mode; column dimension: 100 mm (total length 400 mm)×100 μ m i.d.; mobile phase: ACN/H2O (20/80,v/v) containing 5 mmol/L ammonium acetate,pH 4.0; concentration of CM- β -CD: 15 mmol/L; applied voltage: 0-4 kV; pump flow rate: 0.03 mL/min. 1. (±) bupropion hydrochloride; 2. (±) clenbuterol hydrochloride; 3. (±) metoprolol tartrate; 4. (±) esmolol hydrochloride.

考察了乙腈含量、手性选择剂(CM- β -CD)浓度、缓冲盐浓度和pH、施加电压后,确定了4种对映 体盐酸安非他酮、盐酸克伦特罗、酒石酸美托洛尔、盐酸艾司洛尔的最佳分离条件:乙腈/乙酸铵缓冲液(5 mmol/L,pH 4.0,20/80,v/v),CM- β -CD浓度:15 mmol/L,泵流速:0.03 mL/min,分流比约为300 ∶ 1,施加电压:2 kV。样品的分离谱图见图5。在最佳条件下均实现了基线分离,分离度分别为1.55、2.82、1.69、1.70。

图5

Fig. 5

图5 4种手性物质的分离色谱图 Fig.5 Chromatograms of the four enantiomers pCEC mode; column dimension: 100 mm (total length 400 mm)×100 μ m i.d.; mobile phase: ACN/H2O (20/80,v/v) containing 5 mmol/L ammonium acetate,pH 4.0; concentration of CM- β -CD: 15 mmol/L; applied voltage: 2 kV; pump flow rate: 0.03 mL/min; split ratio: 300 ∶ 1. Samples: a. (±) bupropion hydrochloride; b. (±) clenbuterol hydrochloride; c. (±) metoprolol tartrate; d. (±) esmolol hydrochloride.