色谱  2015, Vol. 33 Issue (3): 304-308   PDF (1077 KB)    
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孟梁
朱彬玲
郑可芳
张文文
孟品佳
超声辅助低密度溶剂分散液液微萃取-气相色谱-三重四极杆质谱法检测生物样品中的8种毒品
孟梁1 , 朱彬玲1, 郑可芳1, 张文文2, 孟品佳3    
1. 福建警察学院刑事科学技术系, 福建 福州 350007;
2. 北京市公安局公安交通管理局, 北京 100037;
3. 中国人民公安大学刑事科学技术学院, 北京 100038
收稿日期：2014-12-01
基金项目：福建省教育厅中青年教师教育科研项目(JA14336).
通讯作者：孟梁,Tel:(0591)88037670,E-mail:mlatfy@hotmail.com
摘要：建立了生物样品中8种毒品的超声辅助分散液液微萃取-气相色谱-三重四极杆串联质谱检测方法,采用密度比水低的有机溶剂甲苯作为萃取溶剂,萃取过程中不需要任何分散剂。对影响萃取富集效率的因素进行优化:将100 μL甲苯萃取剂加入到1 mL样品溶液中,超声波剧烈振荡使甲苯充分分散到样品溶液中进行萃取,离心分层后,抽取上层萃取剂供气相色谱-三重四极杆串联质谱分析检测。在优化条件下,分析物在各自的线性范围内具有良好的线性关系,线性相关系数在0.9984~0.9994之间;检出限为0.05~0.40 μg/L (S/N=3);样品加标回收率在79.3%~100.3%之间,RSD<5.7%。本方法具有操作简单、灵敏度高和重现性好等优点,可应用于生物样品中多种毒品的分析检测。
关键词： 超声     分散液液微萃取     气相色谱-三重四极杆质谱     毒品     生物样品    
Ultrasound-assisted low-density solvent dispersive liquid- liquid microextraction for the determination of eight drugs in biological samples by gas chromatography- triple quadrupole mass spectrometry
MENG Liang1 , ZHU Binling1, ZHENG Kefang1, ZHANG Wenwen2, MENG Pinjia3    
1. Department of Forensic Science, Fujian Police College, Fuzhou 350007, China;
2. Traffic Management Bureau, Beijing Municipal Public Security Bureau, Beijing 100037, China;
3. College of Forensic Science, People's Public Security University of China, Beijing 100038, China
Received: 2014-12-01
Abstract: A novel microextraction technique based on ultrasound-assisted low-density solvent dispersive liquid-liquid microextraction (UA-LDS-DLLME) has been developed for the determination of multiple drugs of abuse in biological samples by gas chromatography-triple quadrupole mass spectrometry (GC-QQQ-MS). A total of 100 μL of toluene as extraction solvent was dropped into the sample solution. Then the mixture was sonicated drastically in an ultrasonic bath for 3 min with occasional manual shaking to form a cloudy suspension. After centrifugation at 10000 r/min for 3 min, the upper layer of low-density extractant was withdrawn and injected into the GC-QQQ-MS for analysis. The parameters affecting extraction efficiency have been investigated and optimized. Under the optimum conditions, good linearities were observed for all analytes with the correlation coefficients ranging from 0.9984 to 0.9994. The recoveries of 79.3%-100.3% with RSDs<5.7% were obtained. The LODs (S/N=3) were in the range from 0.05 to 0.40 μg/L. UA-LDS-DLLME technique has the advantages of less extraction time, suitable for batches of sample pretreatment simultaneously, and higher extraction efficiency. It was successfully applied to the analysis of amphetamines in real human urine samples.
Key words: ultrasonication     dispersive liquid-liquid microextraction (DLLME)     gas chromatography-triple quadrupole mass spectrometry (GC-QQQ-MS)     drugs of abuse     biological samples    

几十年来在世界范围内的毒品滥用现象依然严重[1],滥用形式趋向于毒品的混合滥用,例如近期在公安机关破获的贩毒案件中缴获的“奶茶”和“神仙水”等混合型毒品[2]。因此,为了有效遏制毒品犯罪,针对收缴的非法药物和生物样品中的多种毒品及代谢物进行准确、快速、灵敏、有效的同时检测是非常重要的。气相色谱法[3]、高效液相色谱法[4]、毛细管电泳法[5, 6]等是普遍应用的检测方法。

在公安执法实践中,生物样品中毒品的检测越来越趋于常规,但是生物样品组成复杂,目标分析物含量通常较低,因此,在对生物样品中痕量分析物进行检测前采用一种有效的萃取、净化技术至关重要。近年来,分散液相微萃取技术迅速发展,其中超声辅助分散液液微萃取方法(ultrasound-assisted dispersive liquid-liquid microextraction,UA-DLLME)结合超声波萃取与分散液液微萃取二者的优势[7, 8],将有机萃取剂在超声波振荡作用下迅速分散到样品溶液中,该方法不使用分散剂,避免了萃取剂的损失,提高了萃取效率,而采用低密度的有机萃取剂,萃取结束离心分层后,抽取上层萃取剂供仪器分析,操作简单。因此,该方法特别适合生物样品中痕量毒品的分析。本研究建立了尿液和血液样品中8种毒品(甲基苯丙胺、苯丙胺、3,4-(亚甲二氧基)苯丙胺、3,4-(亚甲二氧基)甲基苯丙胺、甲卡西酮、氯胺酮、哌替啶和美沙酮)的超声辅助分散液相微萃取方法,并利用气相色谱-三重四极杆串联质谱仪进行分析,以多反应监测(MRM)模式进行监测,采用母离子/子离子的离子对形式以消除杂质的干扰,提高灵敏度。最后,应用该方法成功地检测了吸毒人员尿液中的苯丙胺。

1 实验部分
1.1 仪器与试剂

7890A-7000A气相色谱-三重四极杆串联质谱联用仪(美国安捷伦公司); TDL-16C高速离心机(上海安亭科学仪器厂)。

盐酸甲基苯丙胺(methamphetamine,MA)、盐酸苯丙胺(amphetamine,AM)、盐酸3,4-(亚甲二氧基)甲基苯丙胺(3,4-methylenedioxymethamphetamine,MDMA)、盐酸3,4-(亚甲二氧基)苯丙胺(3,4-methylenedioxyamphetamine,MDA)、盐酸氯胺酮(ketamine,K)、盐酸甲卡西酮(methcathinone,MACT)、盐酸哌替啶(meperidine)和盐酸美沙酮(methadone)购于中国药品生物制品检定所;内标1-(2-甲氧基苯基)哌嗪(1-(2-methoxyphenyl) piperazine,2-MeOPP)购于百灵威试剂公司;氨水(25% ～28% ,w/w)、甲苯、邻二甲苯、环己酮、正壬醇、乙酸丁酯、乙酸辛酯、正辛醇和苯等试剂均为分析纯,购于国药集团化学试剂有限公司。

1.2 仪器条件

DB-5MS石英毛细管柱(30 m×0.25 mm,0.25 μ m)(美国安捷伦公司);柱升温程序:初始温度100 ℃,保持2 min,然后以20 ℃/min 的速率升温至300 ℃,保持6 min;进样口温度260 ℃;传输线温度280 ℃; EI离子源温度230 ℃,电子能量70 eV;载气为高纯He,流速1.2 mL/min;进样方式为不分流;溶剂延迟3.5 min;进样量1 μ L;扫描离子范围为40～500,优化后的MRM条件见表1。

表1 目标物的GC-MS定性、定量离子 Table 1 Qualitative and quantitative ions of the analytes by GC-MS
1.3 UA-DLLME萃取过程

取尿液或血液1 mL置于2 mL的离心管中,加入25%的氨水0.2 mL,调节pH值至13,然后加入含有2-MeOPP(内标,5 mg/L)的100 μ L甲苯萃取剂,在30 ℃超声条件下剧烈振荡,萃取剂明显分散到样品溶液中,形成雾状体系,振荡3 min后,在 10 000 r/min 的离心速度下离心3 min,甲苯萃取剂浮在上层,用微量移液器或者微量进样针取上层萃取液直接进样,用GC-QQQ-MS检测。

2 结果与讨论
2.1 质谱条件优化

首先在m/z 40～500范围内进行全扫描(Scan),以选择合适的母离子,然后在MS/MS模式下选出母离子相应的子离子,接着在MRM模式下考察5、10、15、20以及25 eV的碰撞能量,从而选出最佳碰撞能量(见表1),最终以离子对及相应的最佳碰撞能量在MRM模式下进行检测,消除了样品基质干扰,提高了检测准确度和灵敏度。

2.2 UA-DLLME萃取条件优化
2.2.1 萃取溶剂的选择

超声波振荡能使有机萃取剂在样品溶液中乳化,使其分散到样品溶液中,增大萃取表面积,而此过程不需要任何分散剂,大大降低了萃取剂的损失,从而提高萃取效率。另外,对于生物样品,尤其是血液样品,分散液液微萃取时宜采用密度比水小的有机溶剂作为萃取溶剂,萃取完全后,在 10 000 r/min 的离心速度下离心3 min,密度比水小的有机溶剂浮在上层,便于微量移液器或者微量进样针吸取。

考察了甲苯、邻二甲苯、环己酮、乙酸乙酯、乙酸辛酯、正壬醇和正辛醇7种有机溶剂对目标物的萃取能力。以目标物与内标物的相对峰面积进行比较,实验结果表明,甲苯、邻二甲苯、乙酸乙酯和乙酸辛酯的萃取效果较好(见图1),但是,经邻二甲苯萃取后,MDA和MDMA的色谱峰出现分叉；而乙酸乙酯对于尿液中的其他物质提取率也较高,杂质较多。因此,选取甲苯作为萃取溶剂。

图1 不同萃取溶剂对萃取效率的影响 Fig.1 Effect of organic solvent on extraction efficiency Sample solution: 1.0 mL,pH 13.0; extraction solvent volume: 100 mL; extraction time: 3 min. Mass concentration of each drug: 250 μ g/L; internal standard: 2-MeOPP,5 mg/L.
2.2.2 样品溶液pH值的选择

调节样品的pH值使分析物分子化,才能被有机萃取剂有效萃取。考察样品溶液在不同pH值条件下的萃取率,实验结果见图2。当溶液pH值为10～13时,目标物与内标物的相对峰面积随pH值的增加而增加;pH值大于13时,相对峰面积略有降低,可能是由于尿液中的杂质与目标物形成竞争作用。因此,本实验选取的溶液pH值为13。

图2 样品溶液pH值对萃取效率的影响 Fig.2 Effect of pH value of sample solution on extraction efficiency Sample solution: 1.0 mL; extraction solvent: toluene,100 μ L; extraction time: 3 min. Mass concentration of each drug: 250 μ g/L; internal standard: 2-MeOPP,5 mg/L.
2.2.3 萃取溶剂体积的选择

考察了50、100、150、200、250 μ L甲苯萃取剂的 萃取效率,实验结果见图3,当溶剂体积低于100 μ L 时,目标物与内标物的相对峰面积随溶剂体积的增加而缓慢上升;高于100 μ L时,相对峰面积降低。当有机溶剂的量太少时,有机溶剂可能会发生损失,或者有机溶剂不能与待测物更加有效地接触,导致萃取效率低;当有机溶剂达到一定的体积后,目标物萃取效率达到峰值,而后再加大萃取溶剂的量,目标分析物浓度反而降低。因此,选择萃取溶剂的量为100 μ L。

图3 萃取溶剂体积对萃取效率的影响 Fig.3 Effect of extraction solvent volume on extraction efficiency Sample solution: 1.0 mL; extraction solvent: toluene; extraction time: 3 min. Mass concentration of each drug: 250 μ g/L; internal standard: 2-MeOPP,5 mg/L.
2.2.4 超声波萃取时间的选择

考察了超声时间分别为1、3、5、7、10 min时对萃取效率的影响。实际上超声波振荡萃取时,只要雾状体系形成,萃取平衡就很容易达到。萃取刚开始时,乳化不完全,而此时轻摇离心管就很容易形成完全乳化体系。实验结果见图4,当振荡时间为3 min时,目标物的提取率最高。如果超声时间过短,有机溶剂与尿液中的目标分析物接触不够充分;时间过长产生热效应导致的有机溶剂以及目标物质自身的挥发,会造成目标物的损失。所以最后选择3 min为超声振荡萃取时间。

图4 萃取时间对萃取效率的影响 Fig.4 Effect of extraction time on extraction efficiency Sample solution: 1.0 mL,pH 13; extraction solvent: toluene,100 μ L. Mass concentration of each drugs: 250 μ g/L; internal standard: 2-MeOPP,5 mg/L.
2.3 方法的线性范围、检出限、回收率和精密度

在优化条件下,采用加标尿液和血液样品考察了方法的线性范围、检出限、回收率和精密度,结果见表2,加标色谱图见图5。所分析毒品在 0.000 3～10 mg/L 范围内具有良好的线性关系,线性相关系数(r)在 0.998 4～0.999 4 之间;检出限为0.05～0.40 μ g/L(S/N=3);加标回收率为79.3% ～100.3% ,RSD为2.4% ～5.7% 。结果表明,本方法具有很高的灵敏度和较好的重现性,能应用于生物样品中多种毒品的分析检测。

表2 分析物在加标尿样和血样中的线性范围、相关系数、检出限、回收率及RSD Table 2 Linear ranges,correlation coefficients,LODs,recoveries and RSDs of analytes in spiked urine and blood samples

图5 优化条件下加标尿样中8种毒品的色谱图 Fig.5 Chromatograms of the eight drugs spiked in a urine sample under optimized conditions a. Scan; b. MRM.
Sample solution: 1.0 mL,pH 13; extraction solvent: toluene,100 μ L; extraction time: 3 min; Mass concentration of each drug: 250 μ g/L; IS (internal standard): 2-MeOPP,5 mg/L.
2.4 实际样品分析

为了验证该萃取方法的实用性,在优化条件下对实际滥用苯丙胺类毒品的尿液进行了萃取和检测。结果尿液中检出甲基苯丙胺和苯丙胺成分,色谱图见图6,含量分别为148 μ g/L 和46 μ g/L。

图6 实际尿样中毒品的MRM离子流色谱图 Fig.6 MRM chromatogram of drugs in a real urine sample The conditions are the same as in Fig. 5.
3 结论

本研究采用超声辅助分散液液微萃取技术-气相色谱-三重四极杆质谱检测了尿液和血液中的8种毒品,该方法使用密度比水小的有机溶剂作为萃取剂,在超声波振荡作用下迅速分散到样品溶液中进行萃取,不使用分散剂,从而提高了萃取效率。采用低密度的有机萃取剂特别适合生物样品的分散液液微萃取。该方法已成功地应用于实际尿样中苯丙胺类毒品的分析。

参考文献
[1]United Nations Office on Drugs and Crime. World Drug Report 2013. [2014-12-01]. http://www.unodc.org/unodc/secured/wdr/wdr2013/World_Drug_Report_2013.pdf
[2]Zhu B, Meng L, Zheng K. Forensic Sci Int, 2014, 242: e44
[3]Wang J F, Sun H F, Ye N S, et al. Chinese Journal of Chromatography (王继芬, 孙洪峰, 叶能胜, 等. 色谱), 2008, 26 (2): 254
[4]Ambach L, Penitschka F, Broillet A, et al. Forensic Sci Int, 2014, 243: 107  
[5]Meng L, Wang Y Y, Meng P J, et al. Chinese Journal of Analytical Chemistry (孟梁, 王燕燕, 孟品佳, 等. 分析化学), 2011, 39(7): 1077
[6]Meng P, Fang N, Wang M, et al. Electrophoresis, 2006, 27: 3210  
[7]Leong M I, Fuh M R, Huang S D. J Chromatogr A, 2014, 1335: 2  
[8]Cortada C, dos Reis L C, Vidal L, et al. Talanta, 2014, 120: 191