兽药在防治微生物及寄生虫引起的疾病方面起着不可替代的作用,主要应用于畜牧业生产、禽类饲养以及水产品养殖。但在兽药使用过程中,滥用、误用以及不遵守休药期等现象屡禁不止,致使畜禽产品中兽药残留日趋严重,由此造成的餐桌污染和引发的中毒事件时有发生,严重威胁人类的健康;因畜禽产品中药物残留超标而被拒绝进口的事件,也给我国农产品出口造成巨大经济损失[1]。 β -内酰胺类( β -lactams)、喹诺酮类(quinolones,QNs)、磺胺类(sulfonamides,SAs)、磺胺类增效剂(sulfonamide potentiator,SPs)及抗寄生虫类(antiparasitics,APs)兽药是畜禽养殖行业中常用的抗菌、抗球虫及抗原虫药物,滥用这些药物易造成畜禽产品的严重污染,可通过食物链在人体内蓄积,使人体产生耐药性及过敏反应等副作用,甚至存在致突变、致畸形、致癌的严重危害。目前,国际食品法典委员会(Codex Alimentarius Commission,CAC)、欧盟、美国、日本以及我国[2, 3]对不同种类动物源性食品(鸡、鸭、鹅等家禽,猪、牛、羊等家畜以及鱼、虾等水产品)中的兽药制定了最高残留限量(maximum residue limits,MRLs),涉及十几类数百种兽药,其MRLs指标大多低至 μ g/kg级水平。因此,建立一种快速、简便、灵敏、可靠、可同时测定畜禽产品中多种兽药的检测方法非常必要,这对促进畜禽产品出口和保障动物源性食品安全具有重要意义。
近年来,分别用于测定这5类药物的方法主要有高效液相色谱法(HPLC)[4]及高效液相色谱-质谱法(HPLC-MS)[5, 6, 7, 8, 9, 10, 11],同时测定上述2～3类兽药的方法也有报道[12, 13, 14, 15, 16, 17, 18],但同时测定上述5类药物在畜禽产品中残留量的液相色谱-串联质谱法(LC-MS/MS)尚未见报道。本研究借鉴Anastassiades等[19]提出的快速(quick)、简便(easy)、廉价(cheap)、高效(effective)、耐用(rugged)、安全(safe)的QuEChERS样品处理技术理念,采用分散固相萃取结合HPLC-MS/MS,通过优化样品前处理及色谱-质谱条件,建立了同时提取、一步净化、一次进样分析,动态多反应监测(dynamic multiple reaction monitoring,DMRM)同时测定畜禽肉中 β -内酰胺类(18种)、喹诺酮类(15种)、磺胺类(21种)、磺胺类增效剂(3种)以及抗寄生虫类(6种)共5类63种兽药的新方法。该方法简便快速、灵敏可靠,能满足各国法规限量要求,可为畜禽产品中药物多残留的定性和定量分析提供技术支持,亦可为动物源性食品中残留兽药的分析提供借鉴。
Agilent 1200 SL Series RRLC/6410B Triple Quard MS快速高效液相色谱-串联四极杆质谱联用仪(美国Agilent公司); AS 3120超声波发生器(天津奥特赛恩斯仪器有限公司); Anke TDL-40B离心机(上海安亭科学仪器厂); DC12H水浴式氮吹浓缩仪(上海安谱科学仪器有限公司); XW-80A快速混匀器(海门市麒麟医用仪器厂)。
甲醇、乙腈、N,N-二甲基甲酰胺均为色谱纯(德国Merck公司);甲酸为LC-MS级(美国Sigma公司);乙二胺四乙酸二钠二水合物(Na2EDTA\52H2O)、乙酸均为分析纯(广州化学试剂厂); C18吸附剂(天津博纳艾杰尔科技有限公司);实验用水为二次蒸馏水。
15种QNs标准品(氟甲喹、萘啶酸、恶喹酸、依诺沙星、氧氟沙星、诺氟沙星、培氟沙星、环丙沙星、洛美沙星、丹诺沙星、恩诺沙星、沙拉沙星、双氟沙星、司帕沙星及马波沙星)、21种SAs标准品(磺胺脒、磺胺醋酰、磺胺吡啶、磺胺嘧啶、磺胺甲嘧啶、磺胺二甲嘧啶、磺胺索嘧啶、磺胺噻唑、磺胺甲噻二唑、磺胺甲氧哒嗪、磺胺对甲氧嘧啶、磺胺间甲氧嘧啶、磺胺氯哒嗪、磺胺邻二甲氧嘧啶、磺胺间二甲氧嘧啶、磺胺甲恶唑、磺胺二甲异恶唑、磺胺苯酰、磺胺喹恶啉、磺胺苯吡唑及磺胺氯吡嗪)、3种SPs标准品(二甲氧甲基苄氨嘧啶、三甲氧苄氨嘧啶及二甲氧苄氨嘧啶)均购自德国Dr. Ehrenstorfer公司;18种 β -内酰胺类标准品(青霉素G、青霉素V、阿莫西林、氨苄西林、苯唑西林、氯唑西林、哌拉西林、双氯西林、萘夫西林、阿洛西林、甲氧西林、头孢拉定、头孢唑啉、头孢哌酮、头孢噻吩、头孢克肟、头孢噻肟及头孢氨苄)均购自中国药品生物制品检定所;6种APs标准品(乙胺嘧啶、氯羟吡啶、氯苯胍、癸氧喹酯、盐霉素及氨丙啉)均购自上海陶素生化科技有限公司。
β -内酰胺类标准品以含50%(体积分数)乙腈的水溶液为溶剂,喹诺酮类标准品以含2%(体积分数)甲酸的乙腈溶液为溶剂,磺胺类及其增效剂标准品以乙腈为溶剂,抗寄生虫类以甲醇为溶剂(如遇难溶物质可先用少量N,N-二甲基甲酰胺溶解),将63种兽药标准品分别配制成质量浓度为1 000 mg/L 的单标准储备溶液,置于棕色储液瓶中避光4 ℃下保存;根据需要,用0.1 mol/L Na2EDTA水溶液-乙腈(80 ∶ 20,v/v)稀释成适当浓度的混合标准工作液,现用现配。
准确称取匀质后的禽畜肉试样2.0 g(精确到0.01 g),置于15 mL带螺旋盖的聚丙烯离心管中,准确加入2.00 mL 0.1 mol/L Na2EDTA溶液,在快速混匀器上充分涡旋混匀1 min;准确加入8.00 mL含1%(体积分数)乙酸的乙腈溶液,涡旋提取2 min,再超声提取5 min,于 4 000 r/min 转速下离心5 min;移取上清液7 mL至另一离心管,加入100 mg C18吸附剂,涡旋混匀30 s,于 4 000 r/min 转速下离心5 min;准确移取5.00 mL上清液至带有1.00 mL刻度的梨形瓶中,于45 ℃水浴中氮吹浓缩至0.8 mL,用水定容至刻度,涡旋混匀,过0.22 μ m滤膜,待上机测定。
取空白基质样品,按1.3节的样品处理方法处理,浓缩至约0.8 mL后,加入1.2节中配制的混合标准工作溶液0.1 mL,用水定容至1.00 mL,涡旋混匀,过0.22 μ m滤膜,即得。
LC条件:Poroshell EC-C18柱(100 mm×2.1 mm,2.4 μ m);柱温30 ℃;流速0.3 mL/min;进样量5 μ L;流动相A为含0.4%(体积分数)甲酸的水溶液,B为甲醇-乙腈(20 ∶ 80,v/v);梯度洗脱程序: 0～1.0 min,2%B～5%B;1.0～2.0 min,5%B～10%B; 2.0～4.0 min,10%B～15%B;4.0～8.0 min,15%B～18%B;8.0～10.0 min,18%B～25%B;10.0～12.0 min,25%B～35%B;12.0～14.0 min,35%B～50%B;14.0～15.0 min,50%B～90%B;15.0～16.0 min,90%B～95%B;16.0～20.0 min,95%B;20.0～20.1 min,95%B～2%B。
MS/MS条件:电喷雾离子源(ESI);正离子扫描模式;DMRM采集方式;干燥气温度350 ℃;干燥气流量10.0 L/min;雾化气压力276 kPa;毛细管电压4 kV; MS1及MS2均为单位分辨率;所有待测药物的质谱采集参数见表 1。
测定方法:取样品溶液和空白基质匹配混合标准工作液各5.0 μ L注入快速液相色谱-串联四极杆质谱仪进行测定,以标准溶液中各峰的保留时间和两对DMRM离子对为依据进行定性,以定量离子的峰面积计算样品中相应待测物的含量。
将配制好的质量浓度为0.5～1.0 mg/L 的63种药物混合工作溶液,在电喷雾离子源下分别进行正离子和负离子全扫描分析,所有待测化合物响应最佳的准分子离子峰均在正离子模式下获得,除部分 β -内酰胺类药物的母离子为[M+NH4]+及氨丙啉母离子为[M]+外,其余4类药物的母离子均为[M+H]+。在这基础上,通过选择离子监测方式分别优化每个化合物的碎裂电压(fragmentor)使其母离子的响应最大化,然后对其采用子离子全扫描分析,通过优化碰撞能量(CE)使得子离子的响应最大化;根据欧盟 2002/657/EC决议中有关质谱分析方法必须不少于4分的规定[20],为每个待测药物选取最佳的两对MRM离子对及相应的参数作为最终的质谱采集参数。
然而,同时测定的化合物数目越多,MRM离子对采集通道也就越多,分配给每个采集通道的离子驻留时间(dwell time)就越少,而离子驻留时间对检测的灵敏度和准确定量有重要影响。为了实现既能同时测定63种化合物,又能提供较高的检测灵敏度和确保定量的准确性,我们采用动态多反应监测模式进行数据的采集。该采集方式下,MRM离子对采集通道根据设定好的待测物保留时间及相应的时间窗口(delta RT),有针对性地开放进行数据采集,而不在此时间窗口内的MRM离子对采集通道将不被开放,这样极大地减少了采集通道的冗余,保证了离子的驻留时间,提高了数据采集效率。
为了获得最佳的色谱分离效果以及最短的分析时间,本研究试验了Poroshell EC-C18柱(100 mm×2.1 mm,2.4 μ m)、CORTECS C18+(100 mm×2.1 mm,2.7 μ m)、BDS Hypersil C18(150 mm×2.1 mm,2.4 μ m)及Atlantis dC18(150 mm×2.1 mm,3.0 μ m)4种不同类型的色谱柱。后两款长度为150 mm的色谱柱分析时间均较长,且分离性能并不突出;CORTECS C18+色谱柱分析时间较短,但喹诺酮类药物的峰形很差;而Poroshell EC-C18色谱柱对63种待测物均有良好的峰形,分析时间也较短,因此选其作为分析柱。
5类兽药的极性差异较大,同类化合物又因结构相似不易分离,尤其是其中8组同分异构体的分离,加上QNs的母核结构中3、4位分别为羧基及酮羰基,极易与Fe3+、Al3+、Ca2+等金属离子形成配合物,造成峰拖尾、展宽,保留时间漂移等现象,这都是药物多残留同时分析色谱分离条件优化的难点。根据以往的经验,我们选择乙腈作为有机相,考察了在水相中添加不同浓度的甲酸、乙酸、甲酸铵及乙酸铵对色谱分离和质谱灵敏度的影响。结果发现,添加甲酸及乙酸时分析物的峰形及其灵敏度普遍较好;由于甲酸酸性更强,其效果优于乙酸,而其余添加剂的加入对分离和响应没有明显的改善。经对甲酸的添加浓度反复试验,最终选择含0.4%(体积分数)甲酸的水溶液作为水相,可以获得较好的效果。
采用选定的流动相和色谱柱,优化梯度洗脱程序,所有待测物都有良好的峰形及较高的灵敏度,其中7组同分异构体均达到基线分离,但有1组同分异构体(SMD、SME及SMM)没有得到较好的分离;尝试向有机相乙腈中加入不同体积分数(5% 、10% 、15% 、20% 、25% )的甲醇,情况有所改善,最终选择甲醇-乙腈(20 ∶ 80,v/v)作为有机相可以获得良好的分离,8组同分异构体的分离情况如图 1所示,所有63种待测物的总离子流色谱图见图 2。
5类待测物中,β -内酰胺类药物大多是以钠盐形式存在,属于极性较强、酸碱环境下相对不稳定的物质,常用的提取溶剂是一定比例的乙腈-水溶液[7, 8];其余4类药物的极性较弱,通常采用乙腈或酸化乙腈为提取溶剂[9, 10, 11, 12]。而禽畜肉的主要基质干扰是蛋白质及脂肪,此外还有少量色素。因此,为兼顾极性不同的各类药物的提取,同时尽可能去除样品基质中的干扰物,我们采用水与有机溶剂(乙腈、乙酸化乙腈及甲酸化乙腈)作为提取剂进行条件优化。有机溶剂如乙腈具有良好的沉淀蛋白质能力,但试验发现,在加入有机溶剂前,必须先用水对样品进行处理,否则将影响大多数药物,尤其是 β -内酰胺类药物的提取回收率。这可能与水具有良好的组织渗透性有关,它能分散样品,涡旋后起到匀浆效果,可增大后续所加有机溶剂与样品的接触面积,而且对于强极性药物来说,水还是良好的提取溶剂。加入有机溶剂提取后,5类药物的平均提取效率如图 3所示。可见 β -内酰胺类及QNs药物的提取回收率受提取溶剂的酸性影响较大,前者提取回收率的高低次序为乙腈＞乙酸化乙腈＞甲酸化乙腈,后者的情况则刚好相反,而其余3类药物的提取回收率均在80%以上,这都与它们的结构和理化性质相符合。此外,QNs的基质效应始终明显,且重复性极差,考虑到这可能与QNs母核结构容易与金属离子形成配合物有关。为此,我们将第一步用到的纯水替换为不同浓度的Na2EDTA水溶液进行试验。EDTA是一个具有六齿配体的良好配合剂,可竞争配合基质中存在的大多数金属离子,使QNs游离出来。结果表明,浓度为0.1 mol/L Na2EDTA水溶液可以很好地降低QNs的基质效应,同时大大改善其重复性。在此基础上继续优化有机溶剂,最终选择1%(体积分数)乙酸化乙腈作为提取溶剂,在此条件下各类化合物均能获得比较理想的回收率。
样品经过乙腈沉淀蛋白质后已经去除了绝大部分干扰物,但仍可能存在少量的脂肪杂质。为了提高净化效率和减少待测物的损失,我们采用分散固相萃取的净化手段。丙基乙二胺(PSA)、C18及石墨化炭黑(GCB)是常用的吸附剂,其中C18具有良好的除脂能力,因此选其作为净化吸附剂。实验比较了不同用量(50、100、200 mg)C18吸附剂的净化 效果,结果表明,100 mg的C18用量可以获得良好 的净化效果,且不会对待测物产生明显的吸附。
在液相色谱-质谱分析中,基质效应是客观存在且不可能完全消除的[21]。为了消除和(或)补偿基质效应给分析结果带来的偏差,通常采用同位素内标、稀释样品溶液、配制基质匹配标准溶液以及优化色谱-质谱条件等方法。本研究通过优化色谱-质谱分离条件以及采用配制空白基质匹配标准溶液的方法很好地消除了样品的基质效应,得到的方法学指标完全能满足残留检测的要求。
在选定的色谱分离条件和质谱测定参数下,将6个水平的系列混合标准工作溶液上机测定。63种药物均以峰面积(y)为纵坐标,以质量浓度(x,μ g/L)为横坐标做定量工作曲线,得到的线性回归方程的相关系数r2在 0.993 5～0.999 9 之间,表明各化合物在相应的浓度范围内呈良好的线性关系。采用标准添加法进行测定,以定量离子信噪比(S/N)大于3确定样品的检出限(LOD),S/N大于10为定量限(LOQ),得到63种药物的LOD为0.1～3.0 μ g/kg,LOQ为0.5～10.0 μ g/kg(见表 2)。
在空白猪肉、牛肉及鸡肉中分别添加3个水平的混合标准溶液进行回收率试验,每个添加水平按本文的实验方法做6次平行测定,得到每个化合物的平均回收率为62.2% ～112.0% ,相对标准偏差(RSD)为3.1% ～16.3%(表略),均符合残留检测有关标准和法规的要求。
采用本文所述方法,对购自市场及超市的猪肉(5例)、牛肉(2例)及鸡肉(3例)进行全面筛查分析,发现在某超市购买的1例猪肉磺胺二甲嘧啶为阳性,定量结果为36.5 μ g/kg,其余样品均未检出本文涉及的63种兽药。为验证本文方法的可靠性,对阳性猪肉样品采用GB/T 20759-2006方法进行验证,其磺胺二甲嘧啶的定量结果为39.6 μ g/kg。可见两种方法的测定结果非常接近，表明本法适用于畜禽产品中兽药残留的定性筛查及定量测定。
本文建立了分散固相萃取-LC-MS/MS同时测定畜禽肉中 β -内酰胺类、喹诺酮类、磺胺类、磺胺类增效剂和抗寄生虫类等63种药物多残留的新方法。该方法采用0.1 mol/L Na2EDTA溶液及含1%(体积分数)乙酸的乙腈涡旋提取,C18吸附剂分散固相萃取净化,动态多反应监测方式测定。与现行国家标准及行业标准相比,该方法能实现同时分析多类药物残留,前处理方法更简便快速,动态多反应监测方式更灵敏可靠,可为畜禽产品中药物多残留的定性及定量分析提供借鉴。
2015, Vol. 33 Issue (4): 354-362
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