气相色谱-飞行时间质谱联用仪(Agilent 7890 Gas Chromatograph/LECO Pegasus 4D HT Time-of-Flight Mass Spectrometer); LNG-T88型真空浓缩仪(江苏太仓华美生化仪器厂); DHG9053A型电热恒温干燥箱(上海顿克仪器科技有限公司);飞鸽牌TGL-16G型低速离心机(上海安亭科学仪器厂); XW-80A型漩涡混合器(上海青浦沪西仪器厂); 5417R型超速低温离心机(Eppendorf,德国); KQ2200B型超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司); BT224S型万分之一分析天平(Sartorius,德国)。

L-2-氯苯丙氨酸(上海瀛正科技有限公司); N,O-双(三甲基硅烷基)三氟乙酰胺(N,O-bis (trimethylsilyl) trifluoroacetamide, BSTFA)(含体积分数为1%的三甲基氯硅烷)(美国Sigma-Aldrich公司);吡啶、甲氧胺(美国Sigma-Aldrich公司); Milli-Q去离子水(美国Millipore公司);甲醇(MeOH)、乙腈(ACN)(色谱纯,德国Merck公司);其他试剂均为市售分析纯。

本研究中所使用血清样本均由大连医科大学附属第一医院提供。慢性乙型肝炎患者纳入标准:(1)HBsAg阳性达6个月以上;(2)影像学表现提示慢性肝损害表现。排除标准:(1)影像学提示肝纤维化表现;(2)乙型肝炎病毒以外的其他病毒感染;(3)其他原因导致的慢性肝病及肾功能不全、血液病等;(4)原发性肝癌、肝转移癌及其他器官的恶性肿瘤;(5)乙肝后肝硬化合并酒精性肝硬化;(6)合并糖尿病、甲状腺功能亢进症、甲状腺功能减低症等代谢性疾病。健康志愿者纳入标准:(1)无肝炎病毒感染史,HBsAg阴性,影像学未发现肝脏器质性病变;(2)无饮酒史。排除标准:(1)既往有慢性心脏、脑、肝脏、肺、肾等器质性疾病;(2)有恶性肿瘤、免疫系统及代谢类疾病病史。医院方面负责记录健康对照者的年龄、性别等身体信息。所有患者及健康志愿者均签署了知情同意书,并详细了解了本研究的目的和方法。

65例血液标本均在入院后用药前空腹时采集,将血液抽入到血清分离胶促凝管中,等待30 min后,于4 ℃下以 3000 r/min 离心20 min,取上清液置于1.5 mL塑料离心管中,密封,登记组别及编号,立即保存于-80 ℃冰箱中,运输途中统一采用干冰盒包装。

血清样品室温溶解后各取100 μ L,加入10 μ L 0.3 mg/mL 的L-2-氯苯丙氨酸水溶液作为内标,涡旋混合后再加入300 μ L冷甲醇-氯仿混合溶液(3 ∶ 1, v/v),涡旋混合,于-20 ℃静置10 min,然后于4 ℃下 15000 r/min 离心15 min,取上清液于气相色谱进样小瓶中,离心浓缩干燥^[11]。然后向气相色谱进样小瓶中加入80 μ L甲氧胺吡啶溶液(15 mg/mL),涡旋后放入烘箱^[12], 30 ℃肟化反应1.5 h。接着加入80 μ L BSTFA,涡旋混合后放入烘箱,70 ℃下进行三甲基硅烷化反应1 h。

质量控制(quality control, QC)血清样品的制备:随机选取一些健康人和患者的血清样品,于室温下解冻,从每份样品中取少量混合后得到混合血清样本。前处理方法与各疾病组和健康组保持一致,平行处理。

色谱柱:DB-5MS毛细管柱(30 m×250 μ m×0.25 μ m, Agilent J&W Scientific,美国)。样品不分流进样,进样量1 μ L。进样口温度280 ℃;离子源温度220 ℃;接口温度270 ℃。升温程序:起始温度80 ℃,保持0.2 min,以10 ℃/min 升至180 ℃,以5 ℃/min 升至240 ℃,以20 ℃/min 升至280 ℃,保持11 min。载气为氦气,载气流速1 mL/min。电离方式:EI;电子能量:70 eV;质谱扫描范围:m/z 20～600;全扫描方式,TOF质谱图采集10张/秒。

为了减小在整个分析过程中可能产生的仪器系统误差,所有被检测的正常人和患者的血清样品按照随机排序进样分析。为了考察系统的稳定性,每进样10个血清样品之后,再进样一次QC血清样品。

原始GC-TOFMS数据文件通过Leco公司的数据处理软件包ChromaTOF(版本4.50)进行处理。峰对齐后得到四维数据:化合物的保留时间和特性指标(质荷比)、样本名称以及峰面积。去除提取数据中的溶剂峰、柱流失物峰、BSTFA衍生过程中产生的冗余峰等,再以内标峰校正各变量。样本中差异代谢物的鉴定采用如下方法:利用GC-MS工作站软件把每个化合物的特征碎片与NIST 11数据库中的标准品碎片进行比对^[13],匹配标准是质谱碎片离子图匹配相似度＞700。同时参考了实验室前期工作的物质比对结果^{[11, 14]}。

将上述归一化后的数据导入到SIMCA-P11.5软件包(Umetrics, Ume,瑞典)用于多维统计。首先采用非监督性的主成分分析(principle component analysis, PCA)来观察各组样本之间的整体分布状况,通过QC样品的聚集状态考察整个分析批的仪器系统稳定性。为了进一步放大疾病组与正常组之间的差异,我们还采用了有监督性的多维分析方法正交偏最小二乘法判别分析(orthogonal partial least squares-discriminant analysis, OPLS-DA)方法,同时对所建立的OPLS-DA模型进行200次响应排序检验,用来评价模型的准确性,选取变量重要性投影(the variable importance in the projection, VIP)值＞1的差异代谢物。所得到的临床样本数据除了采用多维统计方法进行分析之外,本研究同时选用非参数检验Wilcoxon-Mann-Whitney检验,选定P ＜ 0.05为有显著性差异。

为了减小由疾病以外的因素引起的代谢水平的差异,在收集各组样本时尽量挑选年龄、性别相匹配的人员。本文所使用的乙型肝炎患者组以及健康对照组的血清样本临床信息如表1所示,经SPSS19.0进行卡方检验后得出,乙型肝炎病例和健康对照组间的年龄分布无显著差异(χ²=0.385, P=0.585),性别在各组间的分布也无显著差异(χ²=2.6, P=0.107)。

表1

Table 1

表1(Table 1)

表1 乙型肝炎患者组和健康对照组血清样本临床信息表 Table 1 Demographics and characteristic of HBV patients and healthy controls Group Age/year Gender Male Female HBV patients (n=30) 47.7±15.2 15 15 Healthy controls (n=35) 51.5±16.2 20 15

表1 乙型肝炎患者组和健康对照组血清样本临床信息表 Table 1 Demographics and characteristic of HBV patients and healthy controls

将QC血清样品于实验前连续进样5针,计算5次进样所得总离子流色谱图中的内标物质色谱峰保留时间和其响应值的RSD。结果表明,保留时间的RSD均小于1% ,峰面积的RSD均小于5% ;对整个实验过程中每隔10个样品插入一次的QC血清样品的谱图数据提取内标响应值,RSD小于10% 。说明仪器的精密度良好,运行稳定,实验结果具有良好的重复性,在整个实验过程中由仪器系统误差引起的变异较小,实验数据偏差小,结果稳定可靠。因此,本研究中所发现的代谢轮廓差异能够真实反映样本组间本身的生物学状态的差异。

乙型肝炎患者和正常人血清经GC-TOFMS检测后得到的典型总离子流图见图1,由谱图可见色谱峰数量较多,色谱峰之间分离度良好。可以较直观地看出两组代谢物的组成和比例上有差异,代谢物浓度的变化代表着生理状态的差异。

图1

Fig. 1

图1 GC-TOFMS分析典型正常人与乙型肝炎患者血清的离子流色谱图 Fig.1 Typical total ion current (TIC) chromatograms of serum samples obtained from an HBV patient and a healthy control using GC-TOFMS analysis

在多维统计方法中,我们首先采用无监督的PCA方法对所有测试样本做一个总体的轮廓分布趋势分析,观察不同分组之间的分离程度,排除异常离散样本点。图2是GC-MS数据经PCA简化降维后的得分图,可见正常人与患者样本具有一些分离趋势,但不能完全分开。此外,PCA分析得到的结果还表明,QC血清样本点在全体样本中较为密集地聚集在一起,表现出较好的稳定性与可靠性。

图2

Fig. 2

图2 GC-TOFMS分析乙型肝炎患者、正常人和质控样本血清代谢轮廓的PCA得分图 Fig.2 Metabolic profiles depicted by PCA scores plot of GC-TOFMS spectral data from serum samples of QCs, healthy controls, HBV patients

为了进一步排除组内误差的干扰,消除非疾病因素及其他随机误差的影响,最大化组间差异,以便寻找组间差异性代谢物,我们采用监督性的OPLS-DA分析方法更好地去除了与样品分组不相关的差异,对不同组间的血清样本代谢全谱进行区分考察(见图3)。

图3

Fig. 3

图3 基于GC-TOFMS的HBV患者和正常人血清代谢轮廓比较的OPLS-DA得分图 Fig.3 OPLS-DA scores plot between HBV patients and healthy controls from serum samples by GC-TOFMS

从图3中可以清楚地看到正常组样本与HBV患者的样本能得到很好的区分。模型的解释率和预测率均较高(R²Y=0.814, Q²Y=0.645)。进一步采用200次响应排序检验,结果所有通过随机排序计算得到的R²和Q²值均小于原始值,且Q²回归直线与Y轴有负截距(见图4),说明模型是有效的,没有过拟合。

图4

Fig. 4

图4 OPLS-DA模型的200次响应排序检验 Fig.4 Two hundred response permutation tests for OPLS-DA model

根据多维统计和非参数检验的分析方法,从518个代谢物变量中选取区分HBV患者和正常人的重要代谢物变量,共找到10个重要差异性变量,如表2所示。

表2

Table 2

表2(Table 2)

表2 基于GC-TOFMS的正常人与HBV患者的血清差异代谢物 Table 2 Representative differential metabolites in serum contributed from the separation between the HBV patients and the healthy controls derived from GC-TOFMS No. VIP P FC Metabolite Metabolic pathway 1 11.37 3.30×10-2 44.97 citric acid tricarboxylic acid cycle 2 5.68 2.50×10-2 0.72 aminooxyacetic acid glyoxylate and dicarboxylate metabolism 3 5.67 2.60×10-2 0.70 glucose glycolysis/gluconeogenesis 4 5.43 ＜0.0005 1.56 5-oxoproline glutathione metabolism 5 3.55 6.00×10-3 2.12 N,N-dimethylglycine glycine, serine and threonine metabolism 6 2.64 1.00×10-3 0.66 glutamine pyrimidine metabolism 7 2.39 ＜0.0005 9.13 malonic acid pyrimidine metabolism 8 2.16 1.60×10-2 7.86 aconitic acid tricarboxylic acid cycle 9 1.27 3.50×10-2 1.73 pyruvic acid glycolysis/gluconeogenesis; tyrosinemetabolism 10 1.04 2.50×10-2 0.85 tyrosine tyrosine metabolism P: P value obtained from Wilcoxon-Mann-Whitney test. VIP: the variable importance in the projection; FC (fold change) with a value larger than 1.0 indicates a relatively higher concentration present in HBV patients, while FC value lower than 1.0 means a relatively lower concentration as compared with the healthy controls.

表2 基于GC-TOFMS的正常人与HBV患者的血清差异代谢物 Table 2 Representative differential metabolites in serum contributed from the separation between the HBV patients and the healthy controls derived from GC-TOFMS

选择两组间倍数变化(FC)超过1.5倍的物质,同时用SPSS 19.0对这些物质分别做受试者工作特征曲线(receiver operating characteristic (ROC) curve),选择ROC曲线下面积(area under the ROC curve, AUC)非常大的物质进行组合,拟合成综合变量(multivariable),进一步做ROC曲线,进行联合诊断。

最终在血清代谢物中筛选出了柠檬酸、乌头酸、谷氨酰胺、N,N-二甲基甘氨酸、丙二酸等5个代谢物。使用SPSS 19.0统计软件中的逻辑回归算法(logistic regression)将这5个能够高效地区分HBV患者和正常人的显著差异代谢物变量拟合为一个综合变量,绘制其在HBV诊断判别中的ROC曲线,计算该代谢物综合变量的AUC值。

从图5中可以看到,区分HBV患者与正常人的AUC值可达到0.975,因而其具有很高的诊断准确度。可以认为这5个代谢物能够作为区分HBV患者和正常人血清的潜在小分子标志物。

图5

Fig. 5

图5 由柠檬酸、乌头酸、谷氨酰胺、N,N-二甲基甘氨酸、丙二酸拟合的代谢物综合变量的ROC分析 Fig.5 ROC curve analysis of integrated data from serum metabolites including citric acid, aconitic acid, glutamine, N,N-dimethylglycine and malonic aci

通过对乙型肝炎病人和正常人血清样本的研究发现,患者体内的柠檬酸、乌头酸的表达水平都有显著性增高。这两种物质是三羧酸循环中关键的中间代谢产物。三羧酸循环是生物体内糖类、脂肪和蛋白质有氧代谢的关键环节,也是正常状态下机体能量代谢的最主要途径。生物体内能量的产生和利用障碍均可能会影响三羧酸循环的代谢过程。乙肝病人血清中柠檬酸升高44.97倍,顺乌头酸升高7.86倍,而其上游代谢产物丙酮酸在患者血中浓度仅轻度升高(1.73倍),这提示患者体内三羧酸循环中催化柠檬酸、顺乌头酸合成异柠檬酸的限速酶异柠檬酸脱氢酶可能发生异常。

丙二酸是脂肪酸的代谢产物,涉及脂质重新合成途径^[15],其在乙肝患者体内升高9.13倍,提示乙肝患者的脂肪酸代谢发生障碍。同时,丙二酸是琥珀酸脱氢酶的强抑制剂,丙二酸可竞争性抑制呼吸电子传递链的琥珀酸脱氧酶^[16],抑制细胞的有氧呼吸。大量文献^[17]证明,实体肿瘤的代谢特点就是无氧糖酵解增强和有氧呼吸代谢途径的抑制,那么肝硬化和肝癌的发生是否与细胞氧化呼吸受抑制有关,是非常值得进一步探讨和验证的方向。

谷氨酰胺是人体内最充足的氨基酸,是合成氨基酸、蛋白质、核酸等生物分子的重要前体物质,体内游离的谷氨酰胺具有抗氧化、促进细胞增殖等作用^[18],在肝肾代谢中起重要的调节作用。由于氨基酸在肝脏内的代谢非常旺盛,肝脏病变也必然会影响其代谢过程。肝炎患者体内谷氨酰胺含量明显减少,很可能与肝细胞坏死后代偿性再生造成的谷氨酰胺代谢性消耗有关,提示HBV患者应补充谷氨酰胺。

N,N-二甲基甘氨酸是一种内源性化合物,参与体内甘氨酸、丝氨酸和苏氨酸的代谢过程。N,N-二甲基甘氨酸能够刺激B细胞产生更高的抗体反应,加强T细胞和巨噬细胞的活性;此外,还可以在人体内合成游离基,促进机体组织对氧的利用,具有抗氧化及增进体液和细胞免疫反应的作用^[19]。N,N-二甲基甘氨酸在肝炎患者血清中水平显著增高(2.12倍),提示HBV感染者体内免疫功能活跃,这可能与患者机体抵抗病毒的免疫反应有关。