色谱  2015, Vol. 33 Issue (4): 363-370   PDF (1744 KB)    
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粟有志
刘俊
李芳
雷红琴
李艳美
刘绪斌
高效液相色谱-串联质谱法测定可食性包装材料中22种酸性染料
粟有志1, 刘俊21 , 李芳1, 雷红琴1, 李艳美1, 刘绪斌    
1. 伊犁出入境检验检疫局综合技术服务中心, 新疆 伊宁 835000;
2. 新疆出入境检验检疫局技术中心, 新疆 乌鲁木齐 830063
收稿日期：2014-12-04
基金项目：国家质量监督检验检疫总局科研项目(2013IK187,2014IK258).
通讯作者：刘俊, E-mail: xll1115@sina.com
摘要：建立了可食性包装材料中酸性黄23、酸性红18、酸性蓝7等22种酸性染料的高效液相色谱-串联质谱(HPLC-MS/MS)分析方法。样品以乙腈-甲醇(5:5, v/v)提取,采用Strata-X-AW固相萃取柱净化。待测物经Zorbax Eclipse Plus C18柱(100 mm×3.0 mm, 1.8 μm)分离,以乙腈-10 mmol/L乙酸铵为流动相梯度洗脱;采用电喷雾负离子源(ESI-)、多重反应监测(MRM)模式检测;以保留时间和特征离子对(母离子和两个碎片离子)信息比较进行定性,基质匹配外标法定量。22种酸性染料在各自的线性范围内相关系数(r2)均大于0.991;在3种基质(糯米纸、植物胶囊、明胶胶囊)中方法的定量限(以S/N≥10计)为0.1~2.0 mg/kg, 3个加标水平(1、2、10倍定量限)下,回收率为78.4%~109.5%,相对标准偏差(RSD)为4.6%~14.5%。本方法快速简便、准确可靠,适用于可食性包装材料中多种酸性染料的测定。
关键词： 固相萃取(SPE)     高效液相色谱-串联质谱(HPLC-MS/MS)     酸性染料     可食性包装材料    
Determination of 22 acidic dyes in edible packagings by high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry
SU Youzhi1, LIU Jun2 , LI Fang1, LEI Hongqin1, LI Yanmei1, LIU Xubin1    
1. Comprehensive Technical Service Centre of Yili Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau, Yining 835000, China;
2. Technical Center of Xinjiang Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau, Urumqi 830063, China
Received: 2014-12-04
Abstract: A method for the simultaneous determination of 22 acidic dyes (acid yellow 23, acid red 18, acid blue 7, etc) in edible packagings was developed using high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry (HPLC-MS/MS). The samples were extracted with acetonitrile-methanol (5:5, v/v), and then cleaned up with Strata-X-AW solid-phase extractor. The analytes were separated on a Zorbax Eclipse Plus C18 column (100 mm×3.0 mm, 1.8 μm) by gradient elution with acetonitrile-10 mmol/L ammonium acetate as the mobile phases. The 22 acidic dyes were determined by electrospray negative ion source (ESI-), and multiple reaction monitoring (MRM) mode. The qualitative analysis was based on the retention times and characteristic ion pairs consisting of one parent ion and two fragment ions, and the quantitative analysis was carried out by matrix-matched external standard method. The results showed that the calibration curves had good linearity for the 22 acidic dyes, and the correlation coefficients (r2) were larger than 0.991. The limits of quantitation (LOQs, S/N≥10) were in the range of 0.1-2.0 mg/kg in three different matrices (plant capsule, gelatine capsule, oblatum). The average recoveries were in the range of 78.4%-109.5% for the 22 acidic dyes with the relative standard deviations (RSDs) from 4.6% to 14.5% at three spiked levels (1×LOQ, 2×LOQ and 10×LOQ). This method is suitable for the determination of acidic dyes in edible packagings with the characteristics of high accuracy and precision.
Key words: solid-phase extraction (SPE)     high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry (HPLC-MS/MS)     acidic dyes     edible packagings    

可食性包装材料是指以蛋白质、淀粉、多糖、植物纤维等天然可食性物质为基础原料,通过分子间相互作用而形成的包装薄膜,此类包装薄膜具有可食性、质轻、无毒无味等诸多优点[1]。当前可食性包装材料主要用于产品内包装,如糯米纸、肠衣、胶囊壳、糖衣等。随着现代工业的发展,可食性包装作为一种绿色包装材料,受到越来越多的关注,其应用发展也日趋迅猛。

近年来,在食品中违规使用工业染料的事件频频发生,如媒体曝光不法商家在卤制品中添加酸性橙、豆制品中添加酸性黄,腊肠中加入玫瑰红,辣椒制品中添加苏丹红等,给人们的健康和社会的稳定造生了极大的危害。酸性染料大多属于磺酸型偶氮染料,主要用于纺织、制鞋、造纸等工业领域,具有致畸、致癌性、致突变等毒性作用[2]。目前我国批准使用的酸性染料类食品添加剂有偶氮玉红、苋菜红、日落黄、柠檬黄,而酸性橙、酸性紫、酸性棕等均为食品中非法添加物。可食性包装材料和酸性染料一般均为水溶性,为了改善产品的外观颜色,不法商家在可食性包装材料中添加工业酸性染料,使消费者的健康受到严重的威胁。

目前,国内外对酸性染料的检测方法主要有酶联免疫法[3]、分光光度法[4]、薄层色谱法[5]、毛细管电泳法[6]、液相色谱法[7,8]和液相色谱-质谱联用法[9,10,11,12],常见于肉制品、豆制品、调味品、饮料中的检测。可食性包装材料中工业染料的检测报道较少,仅见李紫薇等[13]建立的同时测定酸性红14、酸性红35和酸性红73的液相色谱方法。为有效控制酸性染料在可食性包装材料中的非法使用,本文通过对样品前处理和仪器条件的优化,建立了固相萃取(SPE)-高效液相色谱-串联质谱测定可食性包装材料中22种酸性染料的分析方法。

1 实验部分
1.1 仪器与试剂

Agilent 1260-6460A液相色谱-串联质谱仪(Agilent公司),配有电喷雾离子源(ESI); Sigma 3-18K台式冷冻离心机(Sigma公司); IKA T18基本型均质器、MS3型涡旋振荡器(德国IKA公司); 24通道固相萃取装置(美国Supelco公司); GM200刀式混合研磨仪(Retsch公司); N-EVAP-112水浴氮吹仪(Organomation公司); Milli-Q Advangtage A10超纯水系统(Millipore公司)。

乙腈、甲醇、丙酮、乙醇、甲酸均为色谱纯;实验用水为Milli-Q超纯水(符合GB/T 6682-2008一级水要求); Strata-X-AW固相萃取小柱(60 mg/3 mL,Phenomenex公司); Oasis HLB、Oasis WAX、Oasis MAX固相萃取小柱(规格均为60 mg/3 mL,Waters公司); Plexa PAX固相萃取小柱(60 mg/3 mL,Agilent公司)。所有标准品纯度均大于98% ;酸性橙Ⅱ、酸性红1、酸性红18、酸性红14、酸性红52、酸性红73、酸性黄11、酸性黄23、酸性黄36、酸性蓝62购自德国Dr. Ehrenstorfer公司;酸性黑1、酸性黑24、酸性蓝7、酸性黄151购自美国Sigma公司;酸性橙10、酸性橙56、酸性红9、酸性黄73、酸性黄79、酸性紫43购自日本TCI公司,酸性绿73、酸性棕282购自上海江莱生物科技有限公司。

1.2 标准溶液的配制

染料标准储备溶液:准确称取标准品10 mg(精确至0.01 mg)于10 mL容量瓶中,用纯水溶解并定容至刻度,配成质量浓度为 1000 mg/L 的标准储备液,储存于4 ℃冰箱中备用。

中间混合标准溶液:根据每种染料在仪器上的响应灵敏度,确定其在混合标准溶液中的浓度,用水稀释染料标准储备溶液得到中间混合标准溶液,其中各染料的质量浓度如下:酸性橙Ⅱ、酸性黄36、酸性红9、酸性蓝62、酸性黑24、酸性黄151、酸性黄73为2.5 mg/L;酸性红52、酸性紫43为5.0 mg/L;酸性橙56、酸性棕282为10.0 mg/L;酸性橙10、酸性红73、酸性蓝7为25.0 mg/L;酸性黄23、酸性红1、酸性红14、酸性黑1、酸性黄11、酸性黄79、酸性绿73、酸性红18为50.0 mg/L。将该中间混合标准溶液稀释,至其终浓度分别为原来的1/2、1/5、1/10、1/20、1/50,得到系列混合标准溶液。

基质匹配标准曲线的配制:准确称取1 g样品(精确到0.01 g),按照1.3节和1.4节方法进行前处理及仪器分析,当各染料的定性、定量离子信噪比均小于3时,确定样品为空白基质;将空白基质按照1.3节前处理,分别用中间混合标准溶液及系列混合标准溶液1 mL溶解残渣,配成基质匹配标准溶液。

1.3 样品前处理

将样品置于混合研磨仪中充分粉碎。取100 g左右作为试样,密封,储存于4 ℃冰箱中备用。称取1 g样品(精确至0.01 g)于50 mL具塞离心管,加入20 mL乙腈-甲醇(5 ∶ 5,v/v),以10000 r/min 均质1 min,以10000 r/min 离心10 min,取上层清液10 mL置于40 ℃水浴中旋转蒸发至干或氮吹至干,用6 mL水分两次超声溶解残渣,将溶解液 全部转移至Strata-X-AW柱(预先用甲醇3 mL、水3 mL活化)中,弃去流出液,依次用水3 mL、甲醇3 mL淋洗萃取柱,弃去淋洗液,抽干萃取柱,最后用6.0 mL氨水-甲醇(5 ∶ 95,v/v)洗脱,收集洗脱液于15 mL试管中,于40 ℃水浴下氮吹至干,用1 mL乙腈-水(1 ∶ 9,v/v)复溶。将复溶液转移至1.5 mL离心管中,以15000 r/min 离心10 min,上清液供HPLC-ESI-MS/MS测定。

1.4 LC-MS/MS条件

色谱柱:Zorbax Eclipse Plus C18柱(100 mm×3.0 mm,1.8 μ m);柱温:30 ℃;进样量:10.0 μ L;流动相:A相为10 mmol/L 乙酸铵溶液,B相为乙腈。梯度洗脱程序如下:0～10.0 min,10%B～50%B;10.0～14.0 min,50%B～90%B;14.0～16.0 min,90%B; 16.01～20.0 min,10%B。

电离模式:电喷雾负离子源(ESI-)模式;多反应监测(MRM);采用2个通道进行数据采集,其中通道1采集时间0～7.4 min;通道2的采集时间7.41～20.0 min。雾化气、鞘气、碰撞气均为高纯氮气;干燥气温度:350 ℃;干燥气流量:9.0 L/min;鞘气温度:250 ℃;鞘气流速:11.0 L/min,毛细管电压:3.5 kV;监测离子对、碰撞能量、碎裂电压见表1。

表1 22种酸性染料的质谱分析参数 Table 1 MS/MS parameters of the 22 acidic dyes
2 结果与讨论
2.1 仪器条件的优化

参照酸性染料的电离性质,本文选择负离子扫描模式。配制22种酸性染料的单一标准溶液,在不接色谱柱的条件下,进行母离子全扫描,确定准分子离子峰。酸性染料分子中一般含有Na,在负离子模式下电离时首先丢失其中的Na离子,形成[M-nNa+nH-H]-的带电离子。利用Optimizer软件对22种酸性染料的子离子、碎裂电压、碰撞能量等参数进一步优化,获得最佳的仪器条件。参照欧盟指令657/2002/EEC决议中有关规定,本文选择离子丰度最高、本底干扰最小的两个离子对作为特征离子对,其中信号较大的离子对作为定量离子。为保证被测染料的灵敏度,根据染料的保留时间,分时段分别监测,同时控制每个时段内监测的离子数目和驻留时间,保证所有监测的化合物都有足够的数据采集点。基于优化条件下的各种酸性染料定量离子的MRM色谱图见图1,建立的22种酸性染料的两通道叠加总离子流色谱图见图2。

采用液相色谱-质谱分析样品时,流动相体系中的有机相一般以乙腈、甲醇为主,水相中适当添加一定量的缓冲物质。比较了不同含量的甲酸水溶液、乙酸铵水溶液、甲酸-乙酸铵水溶液和乙腈及甲醇组成不同流动相的分离效果。结果表明,乙腈-10 mmol/L 乙酸铵水溶液为流动相时,分离效果较好,各酸性染料的响应值较高。通过设定梯度洗脱程序,22种酸性染料可在20 min内完成测试。

图1 22种酸性染料混合标准溶液的MRM色谱图 Fig.1 MRM chromatograms of mixed standard solution of the 22 acidic dyes 1. acid yellow 23; 2. acid red 18; 3. acid orange 10; 4. acid red 1; 5. acid red 14; 6. acid red 73; 7. acid black 1; 8. acid yellow 73; 9. acid orange Ⅱ; 10. acid yellow 11; 11. acid red 52; 12. acid orange 56; 13. acid yellow 36; 14. acid red 9; 15. acid violet 43; 16. acid blue 62; 17. acid blue 7; 18. acid black 24; 19. acid yellow 79; 20. acid yellow 151; 21. acid green 73; 22. acid brown 282.

图2 22种酸性染料的两通道叠加总离子流色谱图 Fig.2 Total ion chromatogram of the 22 acidic dyes by overlapping two channels
2.2 提取溶剂的选择

酸性染料大多含有磺酸基,易溶于水,实验比较了极性较强的水、甲醇、乙腈、乙醇、丙酮对22种酸性染料的提取效果。结果发现,以纯水和甲醇提取时,糯米纸、植物胶囊、明胶胶囊3种基质样品形成糨糊状,离心之后仍然不分层,给后续净化带来困难;乙腈、乙醇、丙酮提取时部分染料的回收率达不到检测要求。进一步尝试乙腈-水(5 ∶ 5,v/v)、乙腈-甲醇(5 ∶ 5,v/v)、丙酮-甲醇(5 ∶ 5,v/v)、丙酮-水(5 ∶ 5,v/v)混合提取溶剂对22种酸性染料的提取效果,结果发现,乙腈-水(5 ∶ 5,v/v)、丙酮-水(5 ∶ 5,v/v)提取时,植物胶囊样品同样形成糨糊状,无法离心分层;丙酮-甲醇(5 ∶ 5,v/v)提取时部分酸性染料的回收率达不到检测要求;乙腈-甲醇(5 ∶ 5,v/v)提取时22种染料的提取回收率可达到检测要求。不同提取溶剂对糯米纸样品中22种酸性染料的提取回收率见图 3。

图3 不同提取溶剂对糯米纸基质中22种酸性染料的提取效率 Fig.3 Extraction efficiencies of the 22 acidic dyes with different extraction solvents in oblatum matrix 1. acid yellow 23; 2. acid red 18; 3. acid orange 10; 4. acid red 1; 5. acid red 14; 6. acid red 73; 7. acid black 1; 8. acid yellow 73; 9. acid orange Ⅱ; 10. acid yellow 11; 11. acid red 52; 12. acid orange 56; 13. acid yellow 36; 14. acid red 9; 15. acid violet 43; 16. acid blue 62; 17. acid blue 7; 18. acid black 24; 19. acid yellow 79; 20. acid yellow 151; 21. acid green 73; 22. acid brown 282.
2.3 净化条件的选择

酸性染料多带有负电子基团的磺酸基和苯环结构,净化用的固相萃取小柱应选择阴离子交换柱或聚合物填料柱为宜。取22种酸性染料混合标准溶液3 mL,分别过60 mg/3 mL的Oasis WAX、Plexa PAX、Strata-X-AW、Oasis MAX、Oasis HLB固相萃取柱,收集流出液,供HPLC-MS/MS测试。结果表明,Oasis HLB柱净化时,流出液颜色较深,约1/3的染料吸附能力在50%以下;带有阴离子交换基团的Oasis WAX、Strata-X-AW、Plexa PAX、Oasis MAX均可以对22种酸性染料完全吸附。

分别采用氨水-甲醇(5 ∶ 95,v/v)、甲酸-甲醇(5 ∶ 95,v/v)、盐酸-甲醇(0.5 ∶ 99.5,v/v)、乙腈、丙酮、二氯甲烷、乙酸乙酯各10 mL为洗脱液对Oasis WAX、Strata-X-AW、Plexa PAX、Oasis MAX SPE柱进行洗脱。结果发现,上述洗脱液均不能将Plexa PAX和Oasis MAX柱中的酸性染料洗脱下来,这可能是由于Plexa PAX和Oasis MAX柱带有强碱性基团,与酸性染料的结合能力强,目标物无法洗脱;对Oasis WAX SPE柱洗脱时,10 mL氨水-甲醇可以将除酸性橙56和酸性黄151以外的20种酸性染料完全洗脱;对Strata-X-AW柱洗脱时,10 mL氨水-甲醇可以将22种酸性染料完全洗脱。故本文选择Strata-X-AW 柱为净化柱,用氨水-甲醇进行洗脱。进一步优化洗脱液的用量,每2 mL洗脱液收集一次,共收集12 mL。分别计算各段流出液中酸性染料的回收率。结果表明,洗脱液体积大于6 mL时回收率在80% ～110%的酸性染料的个数不再增加,平均回收率也无明显提高。本文选择6 mL氨水-甲醇进行洗脱。

2.4 基质效应、线性范围、检出限和定量限

本文采用相对响应值法(基质效应=空白基质标准响应值/纯溶剂标准响应值×100% ,基质效应大于1时,表现为基质增强效应;基质效应小于1时,为基质抑制效应)[14]评价22种酸性染料在糯米纸、植物胶囊、明胶胶囊3种基质中的基质效应,结果见表2。结果表明,样品基质对酸性染料均有抑制效应,71%的基质效应小于80% ,因此基质效应不可忽略。采用基质匹配标准曲线定量可有效地消除样品基质效应。将空白样品按照1.3节方法处理样品,最后分别用中间混合标准溶液和系列混合标准溶液各1 mL复溶残渣,配成基质匹配标准曲线溶液。以峰面积(y)对酸性染料的质量浓度(x,mg/L)作线性回归,绘制标准曲线,22种酸性染料在糯米纸、植物胶囊、明胶胶囊3种基质中的相关系数(r2)均大于0.991;以信噪比(S/N) ≥3确定方法的检出限(LOD),其范围为0. 03～0.6 mg/kg;以S/N≥10确定方法的定量限(LOQ),其范围为0. 1～2.0 mg/kg。22种酸性染料的保留时间、基质效应、线性关系、检出限和定量限详见表2。

表2 22种酸性染料的保留时间(tR)、基质效应、线性关系、检出限和定量限 Table 2 Retention times (tR),matrix effects,linear relationships,LODs and LOQs of the 22 acidic dyes
2.5 方法的准确度和精密度

选择糯米纸、植物胶囊、明胶胶囊空白样品,以1、2、10倍LOQ为加标水平进行回收率试验。将添加了酸性染料混合标准溶液的样品静置30 min,待酸性染料被样品充分吸收后,按照1.3节方法和1.4节条件进行前处理和仪器测定,每个水平重复6次。回收率和相对标准偏差见表3。从表3可以看出,22种酸性染料的回收率为78.4% ～109.5% ,相对标准偏差为4.6% ～14.5% ,表明该方法的准确度高,通用性好。

表3 22种酸性染料在3种基质中的添加回收率和相对标准偏差(RSD)(n=6) Table 3 Spiked recoveries and relative standard deviations (RSDs) of the 22 acidic dyes in matrices (n=6)
2.6 样品测定

利用本方法对市售的28份可食性包装材料样品(其中糯米纸10份、植物胶囊10份、明胶胶囊8份)进行22种酸性染料的测定。结果表明,28份样品均未检出目标分析物。

3 结论

本文通过对仪器参数、提取溶剂、净化条件的优化,建立了可食性包装材料中酸性红1、酸性黄11、酸性蓝62等22种酸性染料的液相色谱-串联质谱分析方法。该方法的定量限、回收率和精密度均满足痕量分析的要求,可为可食性包装材料中此类物质的风险监控提供可靠的技术支持。

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