色谱  2015, Vol. 33 Issue (4): 423-427   PDF (836 KB)    
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叶晓岚
宋粉云
范国荣
毋福海
高效液相色谱法同时测定广陈皮药材中的11种化学成分
叶晓岚1, 宋粉云1, 范国荣2, 毋福海3     
1. 广东药学院药科学院, 广东 广州 510006;
2. 第二军医大学药学院药物分析学教研室, 上海 200433;
3. 广东药学院公共卫生学院, 广东 广州 510024
收稿日期：2014-12-10
基金项目：上海市药物(中药)代谢产物研究重点实验室开放基金项目(2012SHDX1002).
通讯作者：毋福海,E-mail:fuhaiwu@163.com
摘要：采用高效液相色谱法(HPLC)同时测定了广陈皮药材中5-羟甲基糠醛、维采宁-2、橙皮苷、橙皮素、异甜橙黄酮、甜橙黄酮、异黄芩配基甲醚、川陈皮素、3,5,6,7,8,3',4'-七甲氧基黄酮、橘皮素及5-去甲川陈皮素11种化学成分的含量。样品经50%(v/v)甲醇于70 ℃回流提取。在优化的色谱条件(Hanbon Benatach C18色谱柱(250 mm×4.6 mm, 5 μm)为分离柱,乙腈和0.2%甲酸水溶液为流动相,梯度洗脱,流速1.0 mL/min,柱温25 ℃,检测波长280 nm)下,提取液中的各成分分离良好,在选定的浓度范围内呈良好的线性关系(r>0.998),定量限(S/N=10)为0.0502~4.99 mg/L,检出限(S/N=3)为0.0125~1.25 mg/L,平均加标回收率(n=3)为96.4%~102.4%,相对标准偏差为0.25%~4.01%。该方法准确性高、重复性好,可用于广陈皮的质量控制。
关键词： 高效液相色谱法     黄酮类化合物     非黄酮类化合物     广陈皮    
Simultaneous determination of 11 constituents in Citrus reticulate ‘Chachi’ by high performance liquid chromatography
YE Xiaolan1, SONG Fenyun1, FAN Guorong2, WU Fuhai3     
1. School of Pharmacy, Guangdong Pharmaceutical University, Guangzhou 510006, China;
2. Department of Pharmaceutical Analysis, School of Pharmacy, The Second Military Medical University, Shanghai 200433, China;
3. School of Public Health, Guangdong Pharmaceutical University, Guangzhou 510024, China
Received: 2014-12-10
Abstract: An HPLC method was developed for the simultaneous determination of 11 constituents, 5-hydroxymethyl furfural (5-HMF), vicenin-2, hesperidin, hesperetin, isosinensetin, sinensetin, tetramethyl-O-isoscutellarein (TEOS), nobiletin, 3,5,6,7,8,3',4'-heptamethoxyflavone (HEPTA), tangeretin, 5-demethylnobiletin in Citrus reticulate 'Chachi'. The separation was conducted on a Hanbon Benatach C18 column (250 mm×4.6 mm, 5 μm) with acetonitrile and 0.2% formic acid as mobile phases with gradient elution. The flow rate was 1.0 mL/min. The detection wavelength was 280 nm. The column temperature was 25 ℃. The results showed that the correlation coefficients (r) between concentration and chromatographic peak area of the 11 constituents were over 0.998 in the selected linear ranges. The limits of detection (LODs, S/N=3) and limits of quantification (LOQs, S/N=10) of the 11 constituents were in the range of 0.0125-1.25 mg/L and 0.0502-4.99 mg/L, respectively. The average recoveries (n=3) of the 11 constituents were in the range of 96.4%-102.4% and the RSDs were 0.25%-4.01%. The developed method has been successfully applied for the analysis of eight samples from different cultivation regions in Guangdong Province. This method is simple, accurate and effective for the simultaneous determination of the 11 components, and suitable for the quality control of Citrus reticulate 'Chachi'.
Key words: high performance liquid chromatography (HPLC)     flavonoids     nonflavanoids     Citrus reticulate 'Chachi'    

陈皮(pericarrium Citri Retieultae)为芸香科植物橘(Citrus reticulata Blanco)及其栽培变种的干燥成熟的果皮,又名橘皮、红皮、柑皮等,具有理气健脾、和胃止呕、燥湿化痰等多种功效。现代药理学研究表明,陈皮具有抗炎、抗氧化、抗病原微生物及抗癌的作用[1, 2],可用于治疗厌食症、咳嗽多痰等疾病。其活性成分主要为黄酮类化合物,如橙皮苷、川陈皮素、橘皮素等。《中华人民共和国药典》(一部)(2010 版)[3]记载,陈皮药材可分为陈皮及广陈皮,质量以广陈皮为优。广陈皮药材来源较广,正品为茶枝柑(Citrus reticulata‘Chachi’,当地叫大红柑)的干燥成熟果皮,主产于广东新会,故又名新会陈皮,已有700多年的历史。新会陈皮正宗、质优,具有更高的药用价值,为历代众多名医家所推崇,被奉为道地药材,位列十大广药之一。《中华人民共和国药典》(一部)(2010年版)[3]是以橙皮苷作为陈皮及广陈皮质量控制的指标成分。众所周知,仅通过单一指标成分对中药材进行质量控制是远远不够的。近年来,随着分析技术的不断发展,有关广陈皮药材质量研究的报道也越来越多。郑国栋等[4]采用液相色谱-紫外检测技术对不同产地的广陈皮药材中5种黄酮类化合物进行了同时测定,发现多指标成分较单一指标更能反映广陈皮的道地性特色。Li等[5]结合加速溶剂萃取与液相色谱-二极管阵列检测器-电喷雾质谱技术(LC-DAD-ESI-MS)对广陈皮中橙皮苷、橘皮素和川陈皮素进行了定性和定量分析。Liu等[6]采用高分离快速液相色谱-电喷雾-三重四极杆串联质谱(RRLC-ESI-MSn)技术同时测定了广陈皮中柚皮苷、橙皮苷等6个黄酮类化合物。大部分文献仅是针对广陈皮中某类或某些黄酮类化合物的定量研究,少有文献报道同时测定广陈皮中3类或3类以上黄酮类化合物及非黄酮类成分。本研究除了选择广陈皮中常见的黄酮氧苷类化合物,还选择了黄酮碳苷类、多甲氧基黄酮类及非黄酮类化合物(包括5-羟甲基糠醛(5-HMF)、维采宁-2、橙皮苷、橙皮素、异甜橙黄酮、甜橙黄酮、异黄芩配基甲醚(TEOS)、橙皮素、川陈皮素等)11种化学成分作为药材的特征成分,建立了HPLC同时测定广陈皮中11种化学成分的定量分析方法,为广陈皮药材的质量评价提供了依据。

1 实验部分
1.1 仪器、试剂与材料

Shimadzu高效液相色谱系统(日本岛津公司): LC-10ATVP泵,DGU-14A脱气机,SCL-10AVP系统控制器,SIL-10ADVP自动进样器,SPD-10A紫外检测器,LC-solution色谱工作站(Version 1.25)。

多批广陈皮药材经广东药学院药用植物与中药鉴定学教研室刘基柱副教授鉴定为茶枝柑(Citri Reticulata‘Chachi’)的干燥成熟果皮,药材产地及采收时间见表1。5-HMF、橙皮苷、橙皮素、川陈皮素及橘皮素对照品购于中国食品药品检定研究院,维采宁-2、异甜橙黄酮、甜橙黄酮、TEOS、3,5,6,7,8,3′,4′-七甲氧基黄酮(HEPTA)以及5-去甲川陈皮素对照品为实验室自制,通过NMR、MS等方法对其结构进行了鉴定,HPLC峰面积归一化法测定结果表明其质量分数均大于98% 。

表1 8批广陈皮药材的来源及采收时间 Table 1 Sources and collection times of eight Guangchenpi samples

色谱纯甲醇、乙腈(德国Merck公司);色谱纯甲酸(美国ROE Scientific INC.);自制超纯去离子水(18.2 M Ω \5cm,由美国Millipore公司的Milli-Q系统制备)。

1.2 色谱条件

色谱柱:Hanbon Benatach C18柱(250 mm×4.6 mm, 5 μ m,江苏汉邦公司);流动相:乙腈(A)和0.2%(v/v)甲酸水溶液(B);流速1.0 mL/min;梯度洗脱程序:0～10 min,5%A～10%A;10～50 min,10%A～30%A;50～65 min,30%A～45%A;65～85 min,45%A～90%A;85～87 min,90%A～5%A,保持5 min;柱温:25 ℃;检测波长:280 nm;进样量:20 μ L。

1.3 供试品溶液的制备

广陈皮药材经60 ℃干燥,粉碎过50目筛,取约1 g(精确至0.1 mg),置于50 mL烧瓶中,加入50%(v/v,下同)甲醇溶液20 mL,水浴加热(70 ℃)回流提取2 h,放冷,过滤;药渣中再加入50%甲醇溶液20 mL,同样操作提取2次;合并滤液并置于100 mL容量瓶中,加入50%甲醇溶液定容至刻度,摇匀。取一定量的上述溶液以 12000 r/min 离心10 min;取上清液过0.45 μ m微孔滤膜,取续滤液进行HPLC分析。

1.4 混合对照品贮备液的制备

11种对照品经五氧化二磷干燥剂减压干燥24 h。分别精密称取11种干燥对照品适量,置于50 mL容量瓶中,加入50%甲醇溶解稀释成5-羟甲基糠醛为100.2 mg/L、维采宁-2为101.2 mg/L、橙皮苷为999 mg/L、橙皮素为50.2 mg/L、异甜橙黄酮为50.2 mg/L、甜橙黄酮为50.6 mg/L、异黄芩配基甲醚为50.4 mg/L、川陈皮素为253 mg/L、橘皮素为99.6 mg/L、3,5,6,7,8,3′,4′-七甲氧基黄酮为25.2 mg/L 以及5-去甲川陈皮素为10.04 mg/L 的混合对照品贮备液。

2 结果与讨论
2.1 流动相的选择

由文献[7, 8]可知,广陈皮中主要含有母核相似的单糖、双糖碳苷或氧苷及多甲氧基黄酮类化合物,同类化合物之间的极性非常相似,而不同类化合物之间的极性跨度又较大,很难用等度洗脱将其分离。考虑到分析时长的问题,本实验选择比使用甲醇出峰更快的乙腈为有机相，与0.2%(v/v)甲酸水溶液为流动相进行梯度洗脱。

2.2 提取条件的选择

本研究比较了加热回流和超声两种常用的提取方法,结果表明回流提取的效率和得到的色谱峰数目明显多于超声提取,故本文选择加热回流方法提取样品。比较了回流提取时间分别为1、2和3 h的提取效率,结果发现,1 h提取不完全,2 h和3 h的提取效率比较接近,故本文选择提取时间为2 h。还考察了不同含量(25% 、50% 、95% (v/v))甲醇溶液的提取效果,结果发现,25%甲醇溶液的提取液中水相杂质太多,导致2号化合物分离较为困难(见图1),而且大部分多甲氧基黄酮类目标化合物的提取也不是很充分;95%甲醇溶液的提取液中极性较大的目标化合物(尤其是2号化合物)的含量较低,定量较困难,且对于多甲氧基黄酮类化合物的提取也不是很充分;而50%甲醇溶液的提取液中水相杂质相对较少,且极性较大和中等极性的目标化合物都达到适当的提取率,因此本文选择50%甲醇溶液为提取溶剂。<

图1 不同含量甲醇溶液提取液的HPLC谱图 Fig.1 Chromatograms of extracts obtained by methanol solutions with different contents Peak identifications: 1. 5-hydroxymethyl furfural (5-HMF); 2. vicenin-2; 3. hesperidin; 4. hesperetin; 5. isosinensetin; 6. sinensetin; 7. tetramethyl-O-isoscutellarein (TEOS); 8. nobiletin; 9. 3,5,6,7,8,3′,4′-heptamethoxyflavone (HEPTA); 10. tangeretin; 11. 5-demethylnobiletin.
2.3 专属性考察

精密量取混合对照品贮备液1 mL置于10 mL容量瓶中,加入50%甲醇溶液稀释至刻度,得到混合对照品溶液。分别吸取混合对照品溶液和药材供试品溶液各20 μ L,在优化的色谱条件下测定,11种化学成分的分离良好,药材供试品溶液中目标化合物与其他化合物的色谱峰分离良好(见图2),供试品中目标化合物的保留时间与11种对照品的保留时间一致,说明该方法具有良好的专属性。

图2 (a)11种化学成分混合对照品溶液和(b)供试品溶液的色谱图 Fig.2 Chromatograms of (a) the mixed solution of standards and (a) a sample solution Peak identifications are the same as in Fig. 1.
2.4 线性关系

分别精密量取上述混合对照品贮备液0.1、0.2、0.4、1.0、2.0、4.0、8.0 mL于7个10 mL容量瓶中,用50%甲醇溶液稀释定容至刻度,摇匀,制备7个浓度的混合对照品溶液。按照1.2节的色谱条件分别对对照品溶液进行分析,以目标物的质量浓度C(mg/L)为横坐标,峰面积Y为纵坐标进行线性回归,结果见表2。

表2 11种化学成分的线性关系、定量限和检出限 Table 2 Linear relationships, LOQs and LODs of the 11 constituents
2.5 检出限及定量限

以S/N=3时的质量浓度为检出限(LOD), S/N=10时的质量浓度为定量限(LOQ), 11种化学成分的检出限和定量限结果见表2。

2.6 精密度、重复性和稳定性

取上述制备标准曲线的中间浓度的混合对照品溶液,连续重复进样6次,记录峰面积。结果被测定的11种化学成分峰面积平均值的RSD为0.26% ～2.18% ,表明仪器精密度良好。

取同一批广陈皮(采于2008年12月,新会双水)药材6份,按照1.3节的方法制备供试品溶液。按1.2节的色谱条件进行分析,测得供试品中11种化学成分(按图1中的峰顺序)的含量分别为3.101、2.390、19.62、1.410、0.6402、0.3515、0.3422、4.411、0.3012、3.441、0.4041 mg/g, RSD为0.98% ～3.36% ,表明该方法重复性良好。

取同一份广陈皮药材(采于2008年12月,新会双水),按照1.3节的方法制备供试品溶液,分别放置0、3、6、9、12、24 h后进样分析,结果显示11种化学成分平均峰面积的RSD为0.21% ～1.71% ,表明供试品溶液在24 h内稳定性良好。

2.7 加标回收率

精密称取已测定含量的广陈皮样品(采于2008年12月,新会双水)9份,每份约0.5 g,精密称定,分别精密加入低、中、高3个水平的11种化学成分对照品溶液,按1.3节的方法制备供试品溶液并进行分析,每个加标水平平行测定3次，计算回收率。结果表明11种化学成分的加标回收率为96.4% ～102.4% ,RSD为0.25% ～4.01%(见表3),表明方法的准确度良好。

表3 广陈皮样品中11种化学成分的加标回收率(n=3) Table 3 Recoveries of the 11 compounds spiked in a Guangchenpi sample (n=3)
2.8 样品测定

取不同产地广陈皮药材,按照1.3节的方法制备供试品溶液,按1.2节的色谱条件测定8份广陈皮药材中11种化学成分的含量,采用外标法计算样品中各成分的含量平均值。8批药材的测定结果见表4。由测定结果可知,8份不同储存年份的广陈皮中所含11种化学成分有一定差异,但大部分组分,尤其是多甲氧基黄酮类化合物,在8份药材中的含量差异不是很明显(除样品3)。由表4可知,同一产地的药材中橙皮苷的含量随药材储存年份的延长有下降趋势,这与部分文献[9, 10]的报道相符。结合文献报道,本文推测广陈皮中目标化合物的含量不仅仅与储存年份有关,可能也与储存环境、果树树龄等因素有很大的关系。

表4 8批广陈皮药材中11种化学成分的含量(n=3) Table 4 Contents of the 11 compounds for eight Guangchenpi samples (n=3)
3 结论

本文建立了高效液相色谱-紫外检测法同时测定广陈皮药材中5-羟甲基糠醛、橙皮苷、橙皮素、川陈皮素、橘皮素、维采宁-2、异甜橙黄酮、甜橙黄酮、异黄芩配基甲醚、3,5,6,7,8,3′,4′-七甲氧基黄酮及5-去甲川陈皮素11种化学成分含量的方法。实验结果表明,该方法具有准确、简便、经济的特点,可用于测定广陈皮药材中多种化合物的含量,进而可为广陈皮药材的质量控制和药物疗效、药代动力学等相关研究提供参考。

参考文献
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