基质分散固相萃取-超高效液相色谱-串联质谱法测定蔬菜风险监测中的9种农药残留


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巩丽萍 , 石峰, 姜树银, 赵艳霞, 郭常川

山东省食品药品检验研究院, 山东济南 250101

收稿日期：2014-12-10

基金项目：国家食品安全风险监测计划项目(中检办食化函[2013]50号).

通讯作者：巩丽萍, E-mail: gongliping_lp@163.com

摘要：建立了基质分散固相萃取-超高效液相色谱-串联质谱测定蔬菜中多菌灵、氧乐果、克百威、涕灭威、毒死蜱、甲胺磷、甲拌磷、对硫磷、甲基对硫磷9种农药残留的方法。蔬菜通过乙腈提取、盐析分配、基质分散固相萃取净化后,采用Waters BEH C18柱(100 mm×2.1 mm, 1.7 μm),以乙腈和0.1%甲酸水溶液作为流动相,梯度洗脱,电喷雾电离正离子(ESI⁺)、多反应监测(MRM)模式测定,基质匹配标准溶液工作曲线法定量。该方法的检出限为0.8~4.0 μg/kg,回收率为72.8%~117.4%。50批蔬菜样品中毒死蜱、多菌灵和氧乐果残留的检出率分别为42.0%、14.0%和2.0%,毒死蜱超标率为8.0%,其他农药未检出。该法可同时测定食品风险监测中蔬菜的农药残留,具有操作方便、准确率高、重复性好等优点,可满足蔬菜中农药残留的检测要求。

关键词：基质分散固相萃取超高效液相色谱-串联质谱农药残留风险监测蔬菜

Determination of nine pesticide residues in vegetables by matrix solid-phase dispersion-ultra performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry

GONG Liping , SHI Feng, JIANG Shuyin, ZHAO Yanxia, GUO Changchuan

Shandong Institute for Food and Drug Control, Jinan 250101, China

Received: 2014-12-10

Abstract: A matrix solid-phase dispersion-ultra performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry (MSPD-UPLC-MS/MS) method was established for the simultaneous determination of carbendiazin, omethoate, carbofuran, aldicarb, chlorpyrifos, methamidophos, phorate, parathion and parathion-methyl residues in vegetables. The samples were extracted by acetonitrile and separated with salting out method. And then the supernatants were purified by matrix solid-phase dispersion for the UPLC-MS/MS analysis. The separation was performed on a Waters Acquity UPLC system with a BEH C18 column with the gradient elution of acetonitrile and water containing 0.1%(v/v) acetic acid. The nine pesticides were determined in the modes of electrospray positive ionization (ESI⁺) and multiple reaction monitoring (MRM). The analytes were quantified by matrix matched standard solution curves. The limits of detection (S/N≥3) were 0.8-4.0 μg/kg. The average recoveries were 72.8%-117.4%. The detection rates were 42.0% for chlorpyrifos, 14.0% for carbendiazin and 1.5% for dimethoate, and the excessive rate of chlorpyrifos was 8.0% in the determination of 50 real samples; the other pesticides were not detected. The method is simple, accurate and highly reproducible. This method is suitable for the quality control of pesticide residues in risk monitoring of the safety of the foods.

Key words: matrix solid-phase dispersion (MSPD) ultra performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry (UPLC-MS/MS) pesticide residues risk monitoring vegetables

民以食为天,食以安为先,食品安全一直是关乎国家发展、社会稳定和每个人生命健康的重大问题。然而,近年来由于化肥农药污染等原因造成生态环境急剧恶化,食用受到农药严重污染的蔬菜而造成的急性中毒事件屡有发生,所以很有必要控制蔬菜中农药的残留量。蔬菜中农药残留量检测方法有气相色谱法^{[1, 2]}、液相色谱法^[3]、气相色谱-质谱联用法^{[4, 5]}、液相色谱-质谱联用法^{[6, 7]}等,其中液相色谱-质谱联用法具有高分离度、高通量、高灵敏度和应用范围广的特点已成为农药残留研究中强有力的分析技术。

目前蔬菜风险监测的农残对象几乎一个成分一个标准,且样品处理复杂,为提高工作效率,本研究针对当前蔬菜风险监测中所重点监测的农药,建立了蔬菜风险监测中9种农药残留的快速筛查分析方法,适用于日常风险监测中蔬菜中的农残分析。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

Waters Quattro Premier XE超高效液相色谱-三重四极杆质谱联用仪(Waters公司); 3K-18高速冷冻离心机(西格玛公司); KQ-300GDV型恒温数控超声器(昆山市超声仪器有限公司); T25均质机(IKA公司); Vortex-6涡旋振荡器(海门市其林贝尔仪器制造有限公司)。

乙酸、乙腈均为色谱纯;氯化钠、无水硫酸镁均为分析纯;实验用水为超纯水;C18和Primary-secondary amine(PSA)粉末购自安捷伦公司;多菌灵购自Dr. Ehrenstorfer GmbH,批号 90330,含量99.5% ;克百威、涕灭威购自美国R & D公司,批号 210742,含量100% ;其余标准品均购自农业部环境保护科研监测所。

娃娃菜、小黄瓜、韭菜、芹菜、油菜、菜花、茼蒿、卷心菜、茄子、大白菜等日常食用蔬菜均为食品风险监测时购买于市场。

1.2 色谱-质谱条件

色谱柱:Waters Acquity BEH UPLC C18柱(50 mm×2.1 mm,1.7 μ m);柱温:30 ℃;进样量:5 μ L;流动相A: 0.1%(v/v,下同)甲酸水溶液;流动相B:乙腈;梯度洗脱程序:0～1 min,10%B; 1～4 min,10%B～50%B; 4～5 min,50%B～10%B; 5～8 min,10%B;流速:0.2 mL/min。

电喷雾离子源正离子(ESI⁺)扫描模式;毛细管电压:3.5 kV;二级锥孔电压:3.0 V;离子源温度:120 ℃;脱溶剂气温度:350 ℃;脱溶剂气流量:500 L/h;锥孔反吹气流量:50 L/h。定性及定量离子、锥孔电压和碰撞能量见表 1。

表 1 9种农药的质谱采集离子信息 Table 1 Ion information of the nine pesticides acquired by mass spectrometry

1.3 标准储备工作液的配制

精密称取多菌灵、氧乐果、克百威、涕灭威、毒死蜱、甲胺磷、甲拌磷、对硫磷、甲基对硫磷标准品各适量,用乙腈配制成毒死蜱为50 mg/L、其余农药为100 mg/L 的标准储备工作液,于4 ℃冰箱中保存。

1.4 样品制备

1.4.1 样品提取

称取5 g(精确至0.01 g)粉碎好的样品置于50 mL离心管中,加入10 mL乙腈,用均质机于 10 000 r/min 下均质1 min,加入3 g氯化钠,盖上盖子充分振荡,于 5 000 r/min 下离心5 min,取上清液,待净化。

1.4.2 样品净化

称取50 mg PSA粉末、100 mg无水硫酸镁、100 mg C18粉末,置于2 mL聚四氟乙烯具塞离心管中,移取上清液1.5 mL至此离心管中,涡旋混合1 min,于 13 000 r/min 下离心2 min;移取一定体积的上清液,加入石墨化炭黑30 mg,涡旋混合1 min,过0.22 μ m滤膜,供UPLC-MS/MS测定。

2 结果与讨论

2.1 流动相的选择

比较了甲醇、乙腈分别与水、甲酸水、乙酸铵组成的流动相系统的洗脱效果。经过比较洗脱效果和峰形对称性,最终采用乙腈和0.1%甲酸水溶液为流动相进行梯度洗脱,12 min即能完成检测,大大提高了检测效率,且目标峰没有基质干扰。

2.2 提取溶剂和净化剂的考察

本文测定的9种组分的溶解性和极性有较大的差异,因此必须选择合适的提取溶剂才能保证提取效率。实验比较了甲醇、乙腈、丙酮等溶剂的提取效果,结果乙腈的提取效率最高,因此选其作为提取溶剂。另外，新鲜蔬菜样品的含水量较大,加入氯化钠后利用盐析作用可提高提取效率。

净化剂选取了去除脂肪酸等强极性杂质效果较好的PSA,去除维生素、甾醇、油脂等非极性杂质能力较好的C18,去除水分和水溶性杂质效果较好的无水硫酸镁。由于蔬菜常含有大量色素,用上述净化剂处理后得到的提取液颜色有时仍然很深,因此再加入可以脱色的石墨化炭黑净化。在净化过程中同时考察了几种吸附剂粉末的组合使用,在保证净化效果及回收率的前提下选取了1.4.2节的用量。通过净化去除了样品中的较多杂质及色素,提高了检测的信噪比,保证了定量的准确性。本实验在样品提取后进行固相分散萃取,即加入各种吸附剂,可满足净化的要求,且不影响回收率,又不需要用固相萃取柱做进一步的净化,简便易行,节省了大量的人力、物力和时间,适合大批量样品分析。

2.3 质谱参数的优化

质谱的锥孔电压、碰撞能对待测物的裂解有重要的影响,配制1 mg/L 的各成分的单一标准溶液进行质谱条件优化:在电喷雾正离子模式下,通过蠕动泵直接进样方式,优化质谱参数,确定待测物母离子;逐渐改变碰撞能量,通过观察离子响应强度的变化优化碰撞能量;最终确定定量离子、定性离子、碎裂电压及碰撞能量。

2.4 标准曲线、线性范围及检出限

吸取一定量的标准储备工作液,加入空白基质溶液,配制成质量浓度分别为10、20、50、100、200 μ g/L 的标准工作溶液,以质量浓度X( μ g/L)对应各成分定量离子的峰面积Y进行线性回归,绘制标准曲线。结果表明各组分的质量浓度与其峰面积呈良好的线性关系,线性方程、线性范围见表 2。

在不含目标组分的空白蔬菜样品中添加适量的标准工作溶液后,以3倍信噪比计算检出限,以10倍信噪比计算定量限,结果见表 2。

表 2 各组分的线性范围、回归方程、相关系数、检出限及定量限 Table 2 Linear ranges,regression equations,correlation coefficients (r),LODs and LOQs for the nine pesticides

2.5 不同种类蔬菜的基质效应

本文分析的蔬菜产品有娃娃菜、小黄瓜、韭菜、芹菜、油菜、菜花、茼蒿、卷心菜、茄子、大白菜等,本研究在实验时考察了基质效应。通过测定不同样品可看出不同蔬菜之间基质效应的差异(图略)。在样品色谱图中,提取了检测成分的信息后,除了在3.71、7.95 min处有色谱峰出现外,其余位置均无色谱峰。通过与标准品图谱比较可看出3.71、7.95 min处的色谱峰对目标成分的测定无干扰。为了消除更多的基质效应,本研究采取了基质匹配加标曲线测定被检测样品,一定程度上消除了基质效应。

2.6 回收率及精密度

精密称取白菜、茄子、黄瓜、菜花4种阴性样品每份5 g左右,分别加入一定量(低、中、高水平)的混合标准溶液(n=5),按照1.4节的方法进行处理,按1.2节的条件进样测定,计算回收率,结果见表 3。

表 3 方法的回收率和精密度(n=5) Table 3 Recoveries and precisions of the method (n=5)

2.7 样品测定

应用本方法对不同地区市场采购的娃娃菜、小黄瓜、韭菜、芹菜、油菜、菜花、茼蒿、卷心菜、茄子、大白菜等50批样品进行测试,共有21批检测出毒死蜱,其中有4批样品超标;7批检测出多菌灵,1批检测出氧乐果,均未超标;样品中毒死蜱、多菌灵和氧乐果残留检出率分别为42.0% 、14.0%和2.0% ,毒死蜱超标率为8.0% ,其余农药均未检出。图 1为检出氧乐果和毒死蜱的样品色谱图。

图 1 检出氧乐果、毒死蜱样品的MRM谱图 Fig. 1 MRM chromatograms of a sample checked out omethoate and chlorpyrifos

3 结论

本文建立了超高效液相色谱-串联质谱测定蔬菜中多菌灵、氧乐果、克百威、涕灭威、毒死蜱等农药残留的检测方法,方法的前处理简单,更易被应用。实验结果表明本方法具有较好的灵敏度、准确度和精密度,能满足蔬菜中农药残留限量的检测要求,其检测效率远高于应用国家标准方法^{[8, 9, 10, 11]},非常适合大批量蔬菜样品中多种农药残留的定性和定量分析。

参考文献

[1]	Pan S Q, Sun J, Dong J, et al. Chinese Journal of Analysis Laboratory (潘守奇, 孙军, 董静, 等. 分析试验室), 2010, 29(1): 115
[2]	Bidari A, Ganjali R M, Norouzi P, et al. Food Chem, 2011, 126(4): 1840
[3]	Yu Y B, Tan P G, Liu Z X, et al. Chinese Journal of Analytical Chemistry (于彦彬, 谭丕功, 刘宗兴, 等. 分析化学), 2013, 41(8): 1259
[4]	Lu H, Wu G J, Liang S Q, et al. Chinese Journal of Chromatography (鲁红, 吴国杰, 梁世强, 等. 色谱), 2013, 31(9): 885
[5]	Su R, Xu X, Wang X H, et al. J Chromatogr B, 2011, 879(30): 3423
[6]	Xu Z L, Deng H, Deng X F, et al. Food Chem, 2012, 131(4): 1569
[7]	Blasco C, Fernandez M, Pico Y, et al. Anal Chim Acta, 2002, 461(1): 109
[8]	GBT 23380-2009
[9]	SNT 2158-2008
[10]	NYT 761-2008
[11]	SNT 2324-2009

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... 蔬菜中农药残留量检测方法有气相色谱法^{[1, 2]}、液相色谱法^[3]、气相色谱-质谱联用法^{[4 ...}

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... 5]、液相色谱-质谱联用法^{[6, 7]}等 ...

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... 其检测效率远高于应用国家标准方法^{[8, 9, 10, 11]},非常适合大批量蔬菜样品中多种农药残留的定性和定量分析。 ...

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