Agilent 1200高效液相色谱仪(美国Agilent公司)由1200二极管阵列检测器、自动进样器和四级泵组成。色谱柱规格均为25 cm×4.6 mm,分离都在20 ℃下进行,进样量5 μ L,流速为1.0 mL/min,采用等度洗脱模式。 正辛烷、正己烷、乙醇、甲醇、三氟乙酸、三乙胺均为色谱纯,他克莫司、雷帕霉素、依维莫司、坦西莫司、α-生育酚、β-生育酚、γ-生育酚、δ-生育酚、α-生育三烯酚、β-生育三烯酚、γ-生育三烯酚、δ-生育三烯酚、姜黄素、去甲氧基姜黄素、双去甲氧基姜黄素、辣椒素、二氢辣椒素均为分析纯,购自美国Sigma-Aldrich公司。

MCI Gel CRS100按照文献^[11]方法合成。通过天然CF6 (1)与对甲苯磺酰氯在无水吡啶中反应制备甲苯磺酸盐CF6 (2)。使用过量叠氮化钠在95 ℃条件下与甲苯磺酸盐CF6 (2)在水中反应15 h,得到叠氮-CF6 (3)。炔基功能化树脂(4)通过丙炔胺与MCI GEL CSP50/P10 CMS树脂在乙腈/100 g/L NaOH溶液(65 ∶ 35,v/v)中反应制得。点击化学固定化步骤按如下方法完成:向炔基树脂(4)的甲醇/乙腈(50 ∶ 50,v/v)混合溶剂中加入叠氮-CF6 (3),然后一次性加入Cu(I)醋酸盐(0.025 g,0.1 mmol)的2,6-二甲基吡啶溶液,加热反应混合物并搅动48 h。粗制品CF6-CMS (5)过滤后分别使用50 g/L EDTA溶液、水、甲醇、乙腈、丙酮洗涤,然后真空干燥过夜。

Frulic N按照文献^[2]方法合成。将3.00 g硅胶加入80 mL无水甲苯中形成悬浮液,回流2 h后使用Dean-stark分离器共沸移除10 mL含水甲苯。然后向3-(三乙氧基硅)丙基异氰酸盐(2.07 mL,8.00 mmol)的吡啶溶液(15 mL)逐滴加入60 mL CF6 (2.02 g,2.08 mmol)的无水二甲基甲酰胺溶液。反应在70 ℃、氮气保护下连续搅拌5 h。冷却到室温后,将反应液与干燥硅胶混合,将悬浮液加热到110 ℃并保持12 h以合成固定相。

Larihc P和Larihc RN按照文献^[5]方法合成。天然CF6通过化学方法与二氧化硅结合后再衍生化,或者CF6先衍生化再与二氧化硅结合。衍生官能团通过氨基甲酸酯连接CF6。

固定相的粒径尺寸、比表面积、表面孔径和接枝率等参数见参考文献^[4]。以Frulic N为例,用元素分析结果中碳元素的质量分数除以碳原子在环果糖及手臂单元的质量分数计算得到环果糖及手臂在固定相中的质量分数,由此除以硅胶的比表面积得到环果糖在Frulic N色谱柱中的接枝率。

聚苯乙烯键合天然环果糖色谱柱MCI Gel CRS100、硅胶键合天然环果糖色谱柱Frulic N的差别在于色谱固定相支撑物的不同。根据元素分析结果中碳元素的含量计算,MCI Gel CRS100、Frulic N中环果糖的接枝率分别为0.44、0.72 μ mol/m²,该数据显示这两个色谱柱上覆盖了大量的环果糖。但色谱柱的亲疏水性测试结果显示Frulic N具有较强的亲水性,而MCI Gel CRS100却与反相C18色谱柱的疏水性相当^[4]。Frulic N固定相支撑物硅胶与MCI Gel CRS100固定相支撑物聚苯乙烯相比,聚苯乙烯的疏水性较强,亲疏水性测试结果说明包埋在接枝物内部的支撑物仍然对固定相的疏水性产生较大影响。在亲水作用色谱应用中,MCI Gel CRS100对多肽的分离能力远低于Frulic N,进一步说明由于聚苯乙烯较强的疏水性,聚合物键合环果糖色谱柱MCI Gel CRS100不适用于亲水作用模式下极性物质的分离^[4]。

考察了正相色谱条件下MCI Gel CRS100、Frulic N对3种结构相近的免疫抑制剂他克莫司、雷帕霉素、坦西莫司的分离能力(这3种药物的化学结构如图2所示)。在正辛烷/乙醇(85 ∶ 15,v/v)流动相条件下,色谱柱Frulic N可基线分离他克莫司、雷帕霉素、坦西莫司,他克莫司和雷帕霉素的分离度达到2.5(见图3a)。相同流动相条件下,MCI Gel CRS100对他克莫司、雷帕霉素的分离度为1.4(见图3b)。通过减小流动相中乙醇的比例降低流动相的极性,延长了3个化合物的保留时间,MCI Gel CRS100的分离效率仍低于Frulic N(见图3c)。但是与亲水作用色谱条件下极性物质的分离相比,MCI Gel CRS100在正相模式下对非极性物质的分离能力显著提高。结果表明:在正相模式下,固定相对非极性物质的选择性受支撑物聚苯乙烯树脂的疏水性影响较小;MCI Gel CRS100可应用于正相模式下非极性物质的分离,但其分离效率低于Frulic N。

图2

Fig. 2

图2 免疫抑制剂的分子结构图 Fig.2 Molecular structures of immunosuppressive agents

图3

Fig. 3

图3 (a)Frulic N和(b,c)MCI Gel CRS100色谱柱分离免疫抑制剂的色谱图 Fig.3 Chromatograms of immunosuppressive reagents on (a)Frulic N and (b,c)MCI Gel CRS100 columns Mobile phases: a,b. heptane/ethanol (85 ∶ 15,v/v); c. heptane/ethanol (90 ∶ 10,v/v); UV detection wavelength: 254 nm. 1. tacrolimus; 2. rapamycin; 3. temsirolimus.

辣椒素、二氢辣椒素是辣椒中辣味的主要来源,其结构如图4所示。实验比较了Frulic N、Larihc P和Larihc RN对辣椒素、二氢辣椒素的分离能力进而考察固定相衍生基团对色谱分离的影响,色谱图如图5所示。在正辛烷/乙醇(90 ∶ 10,v/v)流动相条件下,Frulic N对辣椒素、二氢辣椒素的分离度为1.5,Larihc P和Larihc RN对辣椒素、二氢辣椒素的分离度达到2.0。即衍生化环果糖色谱柱对结构类似物的分离能力较天然环果糖色谱柱的分离能力强。在手性分子分离中,Larihc P和Larihc RN也展示了优于Frulic N的色谱分离能力,这是由于衍生化基团扩展了环果糖单元的空间结构,进而增加了对手性分子的立体选择性^[5]。本实验结果说明扩展的环果糖结构也增加了其对辣椒素等结构类似物的选择性。

图4

Fig. 4

图4 辣椒碱的分子结构图 Fig.4 Molecular structures of capsaicinoids

图5

Fig. 5

图5 (a)Frulic N、(b)Larihc P和(c)Larihc RN色谱柱分离辣椒碱的色谱图 Fig.5 Chromatograms of capsaicinoids on (a) Frulic N, (b) Larihc P and (c) Larihc RN columns Mobile phase: heptane/ethanol (90 ∶ 10,v/v); UV detection wavelength: 254 nm. 1. capsaicin; 2. dehydrocapsaicin.

有机溶剂的强度、极性、介电常数不仅影响被分离物的传质速率,而且影响分析物和固定相间的相互作用及吸附平衡,由此对色谱分离产生不同的分离效果。实验考察了Frulic N、Larihc P和Larihc RN在不同有机溶剂流动相条件下对维生素E分离的影响。维生素E是天然生育酚的混合物,生育酚有α 、β、γ、δ 等多种形式,维生素E中还含有生育三烯酚,也具有与生育酚相对应的α 、β、γ、δ4种同系物,维生素E的结构如图6所示。

图6

Fig. 6

图6 维生素E的分子结构图 Fig.6 Molecular structures of vitamin E

采用正辛烷/乙醇作流动相时,随着乙醇比例的减小,流动相极性降低,维生素E中各组分分离度逐渐增加,保留时间增长。在正相色谱中,固定相的极性大于流动相的极性,由于极性化合物更容易被极性固定相所保留,所以正相色谱多用于溶于有机溶剂的极性化合物的分离,且组分的保留时间随着流动相极性的降低而增加。但当正辛烷/乙醇的比例达到99 ∶ 1时,Frulic N、Larihc P和Larihc RN 3个色谱柱都不能完全分离维生素E中的8个组分。尤其是β型和γ型生育酚或生育三烯酚,它们的相对分子质量相同,区别是甲基在苯环上的位置不同。采用1,4-二氧六环代替乙醇作有机改良剂,在正己烷/1,4-二氧六环(95 ∶ 5,v/v)流动相条件下,Frulic N和Larihc RN色谱柱仍然不能完全分离各组分(见图7a和7c),但是Larihc P色谱柱可在30 min内完全分离维生素E中的8种组分(见图7b)。Tesarova等^[12]利用线性自由能关系模型考察了正相模式下环果糖色谱柱分离的主要作用力,结果显示氢键酸度、疏水性和极性作用对分析物在环果糖色谱柱上的保留和分离影响较大。1,4-二氧六环的氢键酸度小于乙醇的氢键酸度,1,4-二氧六环代替乙醇后,流动相与固定相之间的氢键作用降低,从而分析物与固定相间的氢键相互作用增强,使分析物的分离度增强。

图7

Fig. 7

图7 (a)Frulic N、(b)Larihc P和(c)Larihc RN色谱柱分离维生素E的色谱图 Fig.7 Chromatograms of vitamin E on (a) Frulic N, (b) Larihc P and (c) Larihc RN columns Mobile phase: hexane/dioxane (95 ∶ 5,v/v); UV detection wavelength: 292 nm. 1.α-tocopherol; 2.β-tocopherol; 3.γ-tocopherol; 4.δ-tocopherol; 5.α-tocotrienol; 6.β-tocotrienol; 7.γ-tocotrienol; 8.δ-tocotrienol.

姜黄素、去甲氧基姜黄素和双去甲氧基姜黄素为常用中药材姜黄中的有效成分,统称为姜黄素类化合物,其结构如图8所示。在正辛烷/乙醇(80 ∶ 20,v/v)流动相条件下,Frulic N、Larihc P和Larihc RN对姜黄素类化合物的分离度均达到1.5,色谱图如图9a所示。

图8

Fig. 8

图8 姜黄类化合物的分子结构图 Fig.8 Molecular structures of curcumins

实验考察了流动相添加剂三氟乙酸对色谱柱Frulic N分离姜黄素类化合物的影响。考虑到高浓度三氟乙酸对色谱柱的伤害,选择0.1%(v/v)的三氟乙酸添加到正辛烷和乙醇组成的流动相中。结果如图9b所示,三氟乙酸的添加并没有显著影响Frulic N对姜黄素类化合物的分离能力,仅缩短了保留时间。Tesarova等^[12]的线性自由能关系模型结果显示正相模式下三氟乙酸的加入对氢键酸度影响较小。本实验结果与上述结论一致。

图9

Fig. 9

图9 流动相添加剂对色谱柱Frulic N分离姜黄类化合物的影响 Fig.9 Effect of additives in mobile phase on the separation of curcumins on Frulic N column Mobile phase: a. heptane/ethanol (80 ∶ 20,v/v); b. heptane/ethanol/TFA (80 ∶ 20 ∶ 0.1,v/v); UV detection wavelength: 254 nm. 1. curcumin; 2. demethoxycurcumin; 3. bisdemethoxycurcumin.

对色谱固定相进行芳香基团衍生是提高手性固定相手性识别能力的常用手段。萘基衍生的手性固定相由于萘基基团的分子刚性和空间结构展示了良好的分离性能。萘基结构中单键的受限转动使得该基团具有手性结构。由于R型萘乙基衍生的手性固定相优于S型^[7],所以本实验采用R型萘乙基衍生的环果糖固定相Larihc RN。

脂肪基团衍生的色谱柱Larihc P和芳香基团衍生的色谱柱Larihc RN对辣椒碱、姜黄化合物的分离性能相当(见图6b和6c),Larihc P对维生素E的分离能力略高于Larihc RN(见图7b和7c)。但是在钌复合物的手性拆分时,只有芳香基团衍生的环糊精手性色谱固定相和环果糖手性色谱固定相(Larihc RN等)可基线分离手性钌复合物^[13,14]。这些实验结果说明脂肪基团衍生环果糖色谱柱和芳香基团衍生的环果糖色谱柱可互相补充,扩大手性药物、结构类似物的分离分析范围。