色谱  2015, Vol. 33 Issue (4): 434-440   PDF (1754 KB)    
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刘菁华
孙振中
黄雪玲
郭霞
孙建华
高效液相色谱-柱后衍生法检测养殖水体及沉积物中11种磺胺药物残留
刘菁华 , 孙振中, 黄雪玲, 郭霞, 孙建华    
上海市水产研究所, 上海市水产品质量监督检验站, 上海 200433
收稿日期：2014-12-15
通讯作者：刘菁华, E-mail: lingqitutu@126.com,ljhcgn@163.com
摘要：建立了养殖水体及沉积物中11种磺胺化合物的高效液相色谱-柱后衍生分析方法。养殖水体过滤后采用HLB固相萃取柱进行净化、富集;沉积物采用甲醇/EDTA-Mcllvaine缓冲液(1:1, v/v)提取,HLB固相萃取柱净化富集。经高效液相色谱分离,用荧光胺衍生试剂进行柱后衍生,荧光检测器检测。对柱后衍生系统参数进行了优化,确定了荧光胺溶液的浓度、流速和反应温度分别为0.2 g/L、0.15 mL/min和50 ℃,磺胺化合物在0.01~1.0 mg/L范围内线性显著,其相关系数r2值大于0.99995。11种磺胺类药物在养殖水体和沉积物中的加标回收率分别为79.3%~100.7%和74.6%~95.3%,相对标准偏差为2.2%~11.0%和2.6%~10.3%,检出限(LOD, S/N=3)为0.9~5.5 ng/L和0.3~1.3 μg/kg,定量限(LOQ, S/N=10)为3.0~18.1 ng/L和1.0~4.4 μg/kg。该法可应用于养殖环境中磺胺类药物的定性定量检测,具有较好的实用性。
关键词： 高效液相色谱     柱后衍生     磺胺     养殖水体     沉积物    
Determination of 11 sulfonamide residues in aquaculture water and sediments by high performance liquid chromatography coupled with post-column derivatization
LIU Jinghua , SUN Zhenzhong, HUANG Xueling, GUO Xia, SUN Jianhua    
Shanghai Fisheries Research Institute, Shanghai Fisheries Technical Extension Station, Shanghai 200433, China
Received: 2014-12-15
Abstract: An analytical method was developed for the determination of 11 sulfonamide compounds in aquaculture water and sediments by high performance liquid chromatography (HPLC) coupled with post-column derivatization. The filtered water sample was purified and concentrated with HLB cartridge, while the sediment sample was extracted with a mixture of methanol and EDTA-Mcllvaine buffer (1:1, v/v), and then purified and enriched through HLB solid-phase extraction. The sulfonamides were separated on a C18 column by HPLC and on-line derivatized with a fluorescamine and detected with a fluorescence detector. The parameters of post-column derivatization system were optimized, and the fluorescamine solution concentration, velocity of reagent solution and reaction temperature were 0.2 g/L, 0.15 mL/min and 50 ℃, respectively. The calibration curves of the method showed good linearity in the range of 0.01-1.0 mg/L, with the correlation coefficients (r2) all above 0.99995. The recoveries were 79.3%-100.7% and 74.6%-95.3% with RSD values of 2.2%-11.0% and 2.6%-10.3% for the 11 sulfonamides in aquaculture water and sediments, respectively. The respective limits of detection (LODs, S/N=3) were 0.9-5.5 ng/L and 0.3-1.3 μg/kg and the limits of quantification (LOQs, S/N=10) were 3.0-18.1 ng/L and 1.0-4.4 μg/kg. The method can be applied to the determination of sulfonamides in the aquaculture environment, and it has a good practicability.
Key words: high performance liquid chromatography (HPLC)     post-column derivatization     sulfonamides (SAs)     aquaculture water     sediments    

磺胺类(SAs)药物是一类具有对氨基苯磺酰胺结构的人工合成抗菌药,被广泛应用于水产养殖中以治疗和预防鱼类疾病[1,2],由于现实生活中存在该药物的滥用现象,导致养殖水体中未被吸收以及残留的药物在水体中累积,并随水中悬浮颗粒沉降,吸附到池塘沉积物中。该类药物降解速度较慢,残留时间长[3,4],通过生物富集作用对水体生态系统和水产品质量产生重要影响,导致市售水产品中该类药物含量超标,对人类健康产生巨大威胁[5,6]。因此,开展养殖水体及沉积物中磺胺类药物残留技术研究,可为保障水产品安全等提供技术支持。

水产养殖环境中磺胺类药物残留检出情况时有发生,何秀婷等[7]对广东沿海大亚湾和阳江两个典型海水养殖区进行调查,结果显示在所有沉积物样品中都能检出磺胺类抗生素,含量(干重)范围为:2.1～35.5 ng/g。阮悦斐等[8]在天津淡水养殖场沉积物中检出5种磺胺类药物,浓度范围为1.15～21.67 μ g/kg。王敏等[9]对滨海养殖虾池水样中抗生素残留情况的调查研究表明,磺胺类药物是主要的残留抗生素之一,磺胺嘧啶、磺胺二甲嘧啶和磺胺甲恶唑是其典型代表,最高质量浓度分别为5.36、7.35和18.5 ng/L。有关磺胺类药物的分析国内外报道均较多,主要有酶联免疫法[10]、气相色谱-质谱法[11]、高效液相色谱法(HPLC)[12,13,14,15,16]和HPLC-质谱联用法[17,18,19,20]。目前较为常用的是HPLC-紫外检测法和荧光检测法,以及液相色谱-串联质谱法。液相色谱-串联质谱法灵敏度较高,杜玥等[21]利用液相色谱-串联质谱法测定猪肉中的23种磺胺,磺胺类药物的定量限(LOQ)为0.2～5.0 μ g/kg。唐才明等[22]采用液相色谱-串联质谱法对水环境中的微量磺胺进行检测,海水和城市污水中抗生素的方法定量限分别为4.5～12.6 ng/L 和11.4～28.6 ng/L。但是液相色谱-串联质谱仪较为昂贵,使用成本较高。液相色谱-紫外检测法的灵敏度较低,卢坤等[23]利用液相色谱-紫外检测法检测蜂蜜中5类抗生素残留,其中4种磺胺类药物的定量限为33.27～40.13 μ g/kg。杨晓蕾等[24]也采用液相色谱-紫外检测法对土壤中3种磺胺抗生素药物进行了检测,3种SAs的检出限(LOD)为15.8～16.5 μ g/kg。而采用HPLC柱后衍生法,经色谱柱分离的磺胺类药物,在柱后反应单元中与荧光胺(fluorescamine)反应,生成具有荧光特性的分子,经荧光检测器定量检测,其检测灵敏度和定性的准确性都有显著提高[25]。李学德等[26]采用HPLC-荧光检测法同时测定蔬菜中3种磺胺类药物残留,3种磺胺类药物的定量限为3.4～4.3 μ g/kg。黄冬梅等[27]采用柱后衍生HPLC法测定虾中14种磺胺类药物残留量,14种SAs的定量限为1.0～5.0 μ g/kg。该法与液相色谱-串联质谱法的灵敏度接近。

HLB固相微萃取柱为应用较多的水样及沉积物中抗生素的萃取富集方法,对样品中含量较多的腐殖质等杂质去除效果显著,样品分析干扰少。本研究针对养殖沉积物及养殖水体,采用HLB固相萃取与HPLC-柱后衍生联立技术,建立了可同时检测11种磺胺类药物残留的检测方法,具有较好的实用性。

1 实验部分
1.1 实验设备与试剂

高效液相色谱仪(Agilent 1100/1200),PCX型柱后衍生仪(美国Pickering Vector公司),Centrifuge 5810R型离心机(德国Eppendorf公司),涡旋振荡器(IKA MS3),超纯水机(美国Millipore公司),Star A型pH计(美国Thermo Scientific Orion公司)。

甲醇和乙腈为色谱纯(TEDIA公司)。乙酸(优级纯)、Na2HPO4、柠檬酸和乙二胺四乙酸二钠购自国药集团化学试剂有限公司。荧光胺(纯度≥99% )购自美国Sigma公司。

磺胺标准品:磺胺嘧啶(sulfadiazine,SD)、磺胺噻唑(sulfathiazole,ST)、磺胺甲基嘧啶(sulfamerazine,SMR)、磺胺-5-甲氧嘧啶(sulfamethoxydiazine,SMD)、磺胺二甲基嘧啶(sulfadimidine,SM2)、磺胺甲氧哒嗪(sulfamethoxypyridazine,SMP)、磺胺氯哒嗪(sulfachloropyridazine,SCP)、磺胺甲基异恶唑(sulfamethoxazole,SMZ)、磺胺多辛(sulfadoxine,SX)、磺胺异恶唑(sulfafurazole,SFZ)、磺胺二甲氧哒嗪(sulfadimethoxine,SDM)购自德国Dr. Ehrenstorfer,纯度均不低于99.0% 。

标准贮备溶液:准确称取11种磺胺标准品各10.0 mg,分别置于10 mL容量瓶中,用甲醇溶解并定容至刻度,摇匀,配制成1 g/L 的标准储备液,密封,-20 ℃保存。

混合标准贮备液:分别取11种磺胺标准贮备液各10 mL于100 mL容量瓶中,用甲醇定容,配制成100 mg/L 混合标准贮备液,于-20 ℃保存。

EDTA-Mcllvaine缓冲液的配制:取12.9 g柠檬酸、27.5 g Na2HPO4和37.2 g乙二胺四乙酸二钠溶于1 L水中,调节pH=4.0。0.2 g/L 荧光胺:取0.04 g荧光胺加入100 mL乙腈、80 mL乙酸和20 mL甲醇溶解。

1.2 样品制备及净化

取100 mL水样,用0.45 μ m滤膜过滤,滤液通过HLB固相萃取柱进行富集(HLB柱使用前用3 mL甲醇和6 mL水活化),富集后干燥10 min,用10 mL甲醇洗脱,洗脱液浓缩至近干,用乙腈-甲醇-2%乙酸(5 ∶ 10 ∶ 85,v/v/v)定容至1 mL待测。

称取5.00 g沉积物样品,置于50 mL聚丙烯离心管中,加入10 mL甲醇-乙二胺四乙酸二钠缓冲溶液(1 ∶ 1,v/v)进行提取;涡旋2 min混匀,超声波提取20 min,再振荡10 min,6000 r/min 离心5 min,取上清液,重复上述操作两次。合并提取液,旋蒸浓缩至10 mL,取2 mL过HLB柱,HLB柱预先用3 mL甲醇和6 mL水活化,上清液过柱后,再用3 mL水和2 mL 5%(v/v)的甲醇淋洗,最后用10 mL甲醇洗脱,氮气吹干后用流动相定容至1 mL,0.22 μ m滤膜过滤后,通过HPLC-FLD分析。

1.3 标准曲线的绘制

用乙腈-甲醇-2%乙酸(5 ∶ 10 ∶ 85,v/v/v)稀释混合标准储备液,取适量稀释后的混合标准储备液用乙腈-甲醇-2%乙酸(5 ∶ 10 ∶ 85,v/v/v)定容至所需标准系列:每种磺胺的质量浓度均为0.01、0.05、0.1、0.25、0.5、1.0 mg/L。取上述混合标准工作液各1 mL,进样检测。绘制11种药物的标准曲线并计算回归方程。

1.4 添加回收率及精密度测定

取养殖水样100 mL,添加目标磺胺抗生素药物溶液,配制10、25和50 ng/L 3个水平,混匀,每个水平设置3个平行样品。取沉积物样品5.00 g,置于50 mL聚丙烯离心管中,定量加入11种磺胺类药物标准品,配制5、10和25 μ g/kg 3个含量水平,混匀,静置。每个水平设置3个平行样品。按照1.2节处理后,取50 μ L进样,经HPLC-FLD检测,根据峰面积计算回收率及精密度。

1.5 检出限和定量限的测定

将11种磺胺类农药分别加入空白样品中,按照1.2节处理后,经HPLC-FLD检测,按S/N=3和S/N=10,确定检出限和定量限。

1.6 分析条件

色谱条件:Agilent Eclipse plus C18色谱柱(250 mm×4.6 mm,5 μ m);流速:0.6 mL/min;柱温40 ℃;激发波长405 nm,发射波长495 nm;进样量50 μ L;流动相为乙腈、甲醇和2%(v/v)乙酸水溶液,梯度洗脱条件见表1。

表1 梯度洗脱条件 Table 1 Gradient elution conditions

衍生化条件:衍生化试剂流速0.15 mL/min;柱温40 ℃;柱后反应器温度50 ℃。

2 结果与分析
2.1 标准曲线

通过HPLC-荧光检测器测定峰面积,以磺胺类化合物的峰面积为纵坐标Y,对应待测物的质量浓度为横坐标X(mg/L),分别获得11种磺胺类药物的标准曲线和回归方程,如表2所示,11种磺胺类药物在0.01～1.0 mg/L 范围内线性显著,其相关系数r2值大于 0.99995,并且具有较好的色谱分离效果(见图1)。

表2 11种磺胺类药物的线性方程及相关系数(r2) Table 2 Linear equations and correlation coefficients (r2) of the 11 sulfonamides

图1 11种磺胺类药物标准溶液(1.0 mg/L)的HPLC-柱后衍生色谱图 Fig.1 Standard chromatogram for the 11 sulfonamides by HPLC-FLD (1.0 mg/L)
2.2 沉积物样品预处理方法的优化

根据磺胺类药物的性质及与沉积物表面的吸附机理,酸性条件有利于破坏氢键,使药物更容易与污泥解离。本方法在2%(v/v)的乙酸和EDTA-Mcllvaine缓冲液中分别加入适量有机试剂作为提取剂,分别研究不同提取剂对养殖沉积物中磺胺抗生素提取效率的影响,比较其提取效果(见图2)。由图2可看出,使用溶剂G作为提取剂,沉积物中11种磺胺均获得较好的回收率,回收率达到70%以上。溶剂E和溶剂F作为提取剂,两者回收率效果相当,回收率均在60%以上。溶剂A和溶剂C作为提取剂,两者回收率亦相近,回收率均高于60% 。由此推断,随着有机相的增加,B和G作为提取剂时,回收率明显提高,单纯使用缓冲盐作为提取剂不如将有机试剂与其配比,获得最佳提取效果。然而,以溶剂D作为提取剂,与较低有机相比例混合试剂相比,回收率反而降低,这可能是由于混合溶液极性增强,弱酸性条件被破坏,导致萃取效率下降。综合考虑,本研究选用溶剂G作为提取剂,由于提取剂中有机相比例较高,且有较强极性,在前处理过程中如果直接通过HLB进行富集浓缩, 目标化合物会随甲醇而流失,使回收率降低,因此,在前处理过程中对提取液进行旋蒸浓缩,减少甲醇对回收结果的影响。研究表明,样品处理过程中同时采用超声和振荡,提取效果更好,提取回收率为74.6% ～95.3% 。

图2 不同提取剂对沉积物中磺胺类药物的提取效果 Fig.2 Extraction efficiencies of sulfonamides from sediments with different extraction solventsA: acetonitrile/2% acetic acid (1 ∶ 19,v/v); B: acetonitrile/2% acetic acid (5 ∶ 15,v/v); C: 2% acetic acid; D: acetonitrile/2% acetic acid(1 ∶ 1,v/v); E: EDTA-Mcllvaine; F: methanol/EDTA-Mcllvaine (4 ∶ 16,v/v); G: methanol/EDTA-Mcllvaine (1 ∶ 1,v/v).
2.3 色谱检测方法的确定
2.3.1 仪器条件的优化

由于磺胺类药物具有弱极性,选用液相色谱较为常用的C18柱作为色谱柱进行分离,结果显示11种磺胺类药物在Agilent Eclipse plus C18色谱柱上获得了理想的分离效果。分离多种磺胺类化合物时,由于化合物之间存在极性差异,单纯采用等度洗脱很难同时分离多组分药物,选用梯度洗脱可以获得良好的分离效果。在洗脱初始阶段采用低比例有机相作为流动相,先将极性强的组分洗脱出来,然后增加有机相乙腈的比例,逐步分离出非极性化合物,进而实现各组分的有效分离。由于磺胺类药物具有弱碱性,pH值对磺胺类化合物在色谱柱上的保留时间有重要影响,因此,可参考肉类及水产品中磺胺类药物的分析方法,在流动相中加入乙酸控制pH值,同时可弱化色谱柱内硅醇基与磺胺之间的相互作用,减少拖尾峰,改善磺胺类药物的色谱峰形,提高分离效果。

2.3.2 柱后衍生条件的优化

柱后衍生效果主要与反应温度、荧光胺溶液浓度和衍生试剂流速有关,为获得稳定的检测效果,本研究针对这3个参数做了条件实验,结果见图3。在0.05～0.3 g/L 范围内,11种磺胺类药物的峰面积随着荧光胺溶液浓度的增加而增大,但是荧光胺浓度过高会在仪器上析出,析出物质沉积在仪器上对仪器造成损害,在满足化合物灵敏度达到检测要求的前提下,确定采用0.2 g/L 的荧光胺溶液。在反应温度40～80 ℃范围内,磺胺嘧啶、磺胺噻唑、磺胺甲氧哒嗪、磺胺甲基嘧啶和磺胺二甲基嘧啶的响应值在50 ℃达到最高,随着温度增加,响应值逐步降低；磺胺5-甲氧嘧啶、磺胺氯哒嗪、磺胺甲基异恶唑、磺胺多辛、磺胺异恶唑和磺胺二甲氧哒嗪在70 ℃达到最高,但响应值变化幅度较小。最终确定50 ℃作为柱后衍生反应温度。化合物峰面积随衍生化试剂流速增大而趋于平稳,因此选择荧光胺流速为0.15 mL/min。

图3 荧光胺溶液浓度、反应温度和流速对11种磺胺类药物峰面积的影响 Fig.3 Influence of concentration,reaction temperature and flow rate of fluorescamine solution on the peak areas of the 11 sulfonamides
2.4 回收率及精密度

养殖沉积物样本在5、10和25 μ g/kg 3个添加水平,采用提取剂甲醇/EDTA-Mcllvaine缓冲液(1 ∶ 1,v/v)进行提取,检测不同浓度的样本溶液,分别测其回收率以及精密度,考察富集效果。养殖水体设定10、25和50 ng/L 3个添加水平,样品过滤后经过HLB固相萃取柱净化、富集后测定,结果见表3和表4。数据表明,养殖沉积物中磺胺类药物的平均加标回收率为74.6% ～95.3% ,相对标准偏差为2.6% ～10.3% 。养殖水体中磺胺类药物的平均加标回收率为79.3% ～100.7% ,相对标准偏差为2.2% ～11.0% 。

表3 养殖沉积物中磺胺类药物的回收率和RSD(n=3) Table 3 Recoveries and RSDs of sulfonamides in sediment samples (n=3)

表4 养殖水体中磺胺类药物的回收率和RSD(n=3) Table 4 Recoveries and RSDs of sulfonamides in aquaculture water (n=3)
2.5 检出限和定量限

在空白养殖水体及养殖沉积物中分别添加磺胺类药物混合标准溶液,以S/N为3时对应的质量浓度为方法的检出限,以S/N为10时对应的质量浓度为方法的定量限。养殖水体中11种磺胺类药物的检出限为0.9～5.5 ng/L,定量限为3.0～18.1 ng/L。养殖沉积物中11种磺胺类药物的检出限为0.3～1.3 μ g/kg,定量限为1.0～4.4 μ g/kg(结果见表5)。

表5 HPLC-FLD测定养殖水体和沉积物样品中11种磺胺类药物的检出限和定量限 Table 5 LODs and LOQs for the 11 sulfonamides in aquaculture water and sediments via HPLC-FLD
2.6 实际样品的检测

应用本方法对上海市郊区某大型养殖基地采集的沉积物及水样进行检测分析,26个样品中均未检出磺胺嘧啶、磺胺噻唑、磺胺甲基嘧啶、磺胺-5-甲氧嘧啶、磺胺甲氧哒嗪、磺胺氯哒嗪、磺胺多辛、磺胺异恶唑、磺胺二甲氧哒嗪。磺胺二甲基嘧啶和磺胺甲基异恶唑在样品中有检出:1个沉积物样品中检出磺胺二甲基嘧啶和磺胺甲基异恶唑，含量分别为5.3 μ g/kg 和7.2 μ g/kg。2个水样中检出磺胺二甲基嘧啶，含量分别为13.4 ng/L 和11.6 ng/L。

3 结论

本研究利用磺胺类药物与荧光胺反应的性质,建立了养殖水体及养殖沉积物中11种磺胺类药物残留的HPLC-柱后衍生技术。该法样品净化效果较好,衍生反应效率较高,11种磺胺的定量限分别为3.0～18.1 ng/L 和1.0～4.4 μ g/kg。与紫外法相比有更高的灵敏度,定性定量准确,且针对性和实用性强,为养殖环境中磺胺类药物的残留检测及其标准制定提供了有力参考。

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