目前,全球有超过 1100 种农药应用于农业生产中[1]。农药的滥用、误用导致农产品中农药残留超标,为此,世界各国和国际组织都发布了农药最大允许残留限量(MRLs)。国际食品法典委员会CAC规定了188种农药在333种食品上的 4106 项MRLs[2];欧盟发布了523种农药在315种食品上的 136923 项MRLs[3];日本《食品中农用化学品残留肯定列表制度》规定了700多种农用化学品的 54785 项MRLs[4]。我国GB 2763-2014《食品中农药最大残留限量》也规定了387种农药的 3650 项MRLs[5]。面对数百种农药残留的检测要求和不同检测目的,选择一种灵敏度高、选择性好,可以快速、高效、多残留同时检测的技术,对于残留分析工作者尤为重要。
目前,应用于农药多残留检测的技术很多,如气相色谱-质谱法(GC-MS)[6]、液相色谱-质谱法(LC-MS)[7]以及色谱-串联质谱法(LC-MS/MS, GC-MS/MS)[8, 9]等。气相色谱-质谱联用技术既具有气相色谱的高分离效能,又利用了质谱准确鉴定化合物结构的特点,现已广泛应用于农药残留检测中,成为复杂基质中痕量化合物定性定量分析的有效工具[10]。2011年,Camino-Sánchez等[11]采用GC-MS/MS测定了果蔬中121种农药残留,确证并分析了 1463 个水果蔬菜样品,农药的平均回收率为80% ～116% ,相对标准偏差低于20% 。2013年,马智玲等[12]采用GC-MS/MS建立了蔬菜、水果中129种农药残留同时检测的分析方法,该方法的定量限达到0.03～16.7 μ g/kg,适用于蔬菜水果中农药多残留的同时快速筛查测定。但GC-MS/MS仍受到分辨率、扫描速率和模式的限制,不能完全满足高通量快速筛查分析的要求。因此,具有高分辨率和高质量精度的飞行时间质谱法(time-of-flight mass spectrometer, TOF/MS)逐渐被应用到农药及其代谢组分的高通量筛查分析中[13, 14]。由于其具有质量范围宽、分辨率高、分析速度快的特点,因此在食品污染物痕量分析中表现出突出优势[15]。近年来,利用GC-TOF/MS检测农药残留也成为新的研究方向。2009年,Hayward等[16]对比了GC-MS与GC-TOF/MS两种方法对人参中170种有机卤化物和有机磷农药的测定结果,GC-TOF/MS提供了更加丰富准确的质量信息,对于大部分农药获得了更高的回收率。2011年,姜俊等[17]建立了蔬菜中64种农药残留固相萃取-全二维气相色谱-飞行时间质谱的测定方法,农药的回收率为68.3% ～117.8% ,相对标准偏差低于10% ,有效缩短了检测时间。2012年,Cervera等[18]建立了一种采用GC-TOF/MS分析果蔬中农药残留的方法,并应用解卷积软件无需添加任何标准物质对非目标化合物进行检测。目前,尚未检索到GC-MS/MS和GC-QTOF/MS应用于果蔬中农药残留检测优劣对比的研究报道。
本文在研究建立水果、蔬菜中208种农药多残留检测方法的基础上,开展了GC-MS/MS和GC-QTOF/MS定性、定量能力,基质效应以及方法学效能的评价研究,结合两种仪器结构上的差异,提出两种仪器在农药残留检测方面的各自特点和适用范围,为残留检测分析提供参考。研究结果发现,GC-MS/MS灵敏度高,线性范围宽,定量能力更加准确;而GC-QTOF/MS在快速筛查和农药残留鉴别以及非目标化合物检测方面表现更为突出。
7890A-7000气相色谱-三重四极杆质谱仪(安捷伦科技公司,美国),配有EI源;7890A-7200气相色谱-四极杆-飞行时间质谱仪(安捷伦科技公司,美国),配有EI源;SR-2DS水平振荡器(TAITEC公司,日本); KDC-40低速离心机(安徽中科中佳科学仪器有限公司,中国); N-EVAP112氮吹浓缩仪(OA-SYS公司,美国); 8893超声波清洗仪(Cole-Parmer公司,美国); PL602-L电子天平(Mettler公司,德国); R-215旋转蒸发仪(Buchi公司,瑞士); T25均质器(IKA公司,德国); TM-1FN涡旋混匀器(ASONE公司,日本)、Milli-Q超纯水机(Merck Millipore公司,美国)。
208种农药标准品纯度≥95% ,购自德国Dr. Ehrenstorfer公司;乙腈、甲苯、正己烷和甲醇等有机溶剂均为色谱纯,购自美国Fisher Scientific公司;醋酸、氯化钠(NaCl)、无水硫酸镁(MgSO4)和硫酸钠(Na2SO4)均为分析纯,购自北京化学试剂厂;SPE柱(Sep-Pak Carbon/NH2, 500 mg/6 mL)购自美国Waters公司;水果、蔬菜样品均购自北京各大超市。
水果、蔬菜样品取可食部分切碎、匀浆。称取10.0 g样品(精确至0.01 g)于80 mL具塞离心管中,加入40 mL 1%(v/v)醋酸乙腈提取液,均质提取1 min,加入1 g NaCl和4 g无水MgSO4,振荡提取10 min; 4200 r/min 离心5 min,取20 mL上清液至鸡心瓶中,于40 ℃水浴中旋转蒸发浓缩至2 mL左右,待净化。向Carbon/NH2 SPE柱中加入约2 cm高Na2SO4,用4 mL乙腈-甲苯(3 ∶ 1, v/v)洗脱剂活化。将样品浓缩液转移至SPE净化柱上,用2 mL洗脱液洗涤样液瓶3次,洗涤液全部移入SPE柱中。最后用25 mL洗脱剂洗脱,洗脱液全部收集至鸡心瓶中,于40 ℃水浴中旋转蒸发浓缩至约0.5 mL,氮气吹干,加入1 mL正己烷超声复溶,经0.22 μ m尼龙滤膜过滤后进行测定[19]。
色谱条件 色谱柱:DB-1701 ms石英毛细管柱(30 m×0.25 mm×0.25 μ m,美国安捷伦公司);柱温:40 ℃;程序升温过程:40 ℃保持1 min,以30 ℃/min 程序升温至130 ℃,再以5 ℃/min 升温至250 ℃,再以10 ℃/min 升温至300 ℃,保持5 min;载气:氦气,碰撞气:氮气,纯度均≥99.999% ,载气流速1.2 mL/min;进样口温度:290 ℃;进样量:1 μ L;进样方式:不分流进样。
质谱条件 EI电压:70 eV;离子源温度:230 ℃; GC-MS接口温度:280 ℃;数据采集方式:多反应监测(MRM);溶剂延迟:A组6 min, B组6 min, C组7 min, D组9 min。
色谱条件 色谱柱:VF-1701ms质谱专用柱(30 m×0.25 mm×0.25 μ m,美国安捷伦公司);柱温、程序升温过程、载气流速、进样口温度、进样量及进样方式同GC-MS/MS;载气:氦气,纯度≥99.999% 。
质谱条件 EI电压:70 eV;离子源温度:230 ℃; GC-MS接口温度:280 ℃;数据扫描方式:TOF-Scan全扫描,质量扫描范围m/z 50～600,采集速率2 spectra/s;溶剂延迟:6 min。
实验选用208种农药作为两种仪器的对比研究对象,包括有机磷类、有机氯类、有机氮类、氨基甲酸酯类及拟除虫菊酯类等多类农药。选择了含水分、色素、糖和有机酸等多种干扰物质且消费量大的苹果、柑橘、番茄和黄瓜作为代表性果蔬样品。
分别在5.0、10.0和20.0 μ g/kg 3个添加浓度下对4种果蔬基质进行添加回收率实验,对前处理方法的准确性和重复性进行了评价。根据欧盟农药残留方法准则要求,回收率需在70% ～120%之间,相对标准偏差(RSD)(n=5)低于20%[20]。4种代表性果蔬(苹果、柑橘、番茄、黄瓜)基质中,93.0%以上的农药回收率在70% ～120%范围内且RSD≤20%(n=5)(具体数据见附表1，http://www. chrom-china.com/UserFiles/File/10.3724SP.J.1123. 2014.12026-supplement.pdf)。实验结果说明前处理方法的准确性和重复性良好,可应用于水果蔬菜中农药多残留的筛查与检测。
本次研究主要从检出限和定量限、线性范围两方面对两种仪器的定量能力进行比较。依据上述前处理方法对空白苹果、柑橘、番茄、黄瓜4种基质进行处理,制备含量在0.5～600 μ g/kg 208种农药的一系列基质标准溶液,在确定的色谱和质谱条件下进行两种仪器的测定,并以质量浓度为横坐标,以农药响应值为纵坐标,建立了208种农药的基质标准曲线。
本次研究以S/N=3计算检出限(LOD),以S/N=10计算定量限(LOQ),并对两种仪器的检出限和定量限进行对比。结果发现4种基质中GC-MS/MS中定量限低于2 μ g/kg 的农药占比≥89.4% ,而GC-QTOF/MS中定量限低于2 μ g/kg 的农药占比≤78.8% 。GC-MS/MS方法仅柑橘和番茄中存在0.5%的农药定量限高于5 μ g/kg,而GC-QTOF/MS方法4种基质定量限高于5 μ g/kg 的农药的占比分别为3.4% 、4.8% 、1.4% 、0.5% (见图1,具体数据在附表2，http:/ /www.chrom-china.com/UserFiles/File/10.3724SP.J.1123.2014.12026-supplement.pdf)。对比发现,4种基质中,GC-MS/MS的LOD和LOQ普遍低于GC-QTOF/MS,因此GC-MS/MS的灵敏度明显优于GC-QTOF/MS。
GC-MS/MS采用MRM模式进行检测,该模式下可实现对目标分析物特定离子的选择性检测,经过两个四极杆的筛选过滤,大大降低了背景噪声,提高了目标离子的信噪比和检测灵敏度。而GC-QTOF/MS采用全扫描模式,扫描全部离子,因此灵敏度降低。由于绝大部分农药的MRL为10 μ g/kg,两种方法测得的4种基质中农药的检出限和定量限均能满足各国农药残留限量标准的要求。
对4种果蔬基质中208种农药线性相关系数(R2)统计发现,GC-MS/MS在苹果、柑橘、番茄和黄瓜4种基质中R2≥0.990的农药占比均为100.0% , GC-QTOF/MS在4种基质中R2≥0.990的农药占比分别为99.0% 、99.5% 、100.0%和100.0% ,两种仪器方法的线性相关性均良好。GC-MS/MS线性范围宽于GC-QTOF/MS的农药占比为65.5% ～79.6% ;而GC-QTOF/MS线性范围宽于GC-MS/MS的农药占比仅为3.9% ～9.9% ;此外,二者线性范围相同的农药占比为14.9% ～24.6%(见表1,具体线性范围数据见附表2，http://www.chrom-china.com/UserFiles/File/10.3724SP.J.1123.2014.12026-supplement.pdf)。两台仪器线性范围的差异主要是由于GC-QTOF/MS采用全扫描模式,对目标物和非目标物均进行采集,因此灵敏度较低,检测时农药浓度过低易受到干扰物质的影响,而浓度过高则影响质量精度,最终影响线性范围的宽度。而GC-MS/MS采用的是MRM扫描模式,只采集特定时间段内的特征离子对,大大降低了背景干扰,提高了分析灵敏度,因此线性范围较GC-QTOF/MS宽。
按照欧盟方法学标准,质谱方法定性确证必须达到4个定性点的要求,定性点越多定性越准确,反之则容易出现假阳性结果[21]。对于低分辨质谱,MRM监测模式下,通常选择2对离子进行定性确认,一对离子计为2～2.5个定性点,因此本实验中GC-MS/MS农药的定性点通常只有4～5个。而对于高分辨质谱(＞10000 FWHM), 采用全扫描模式进行测定,可以同时获得化合物全部碎片离子信息,质量精度≤10 ppm, 1个离子计为2个定性点,使化合物确证更加准确,而本实验中GC-QTOF/MS对每种化合物通常选取3～4个特征离子定性,因此其定性点数量为6～8个,定性识别点数明显高于GC-MS/MS。并且在QTOF模式中经过四极杆筛选后的母离子在碰撞池中进一步碎裂,可以获得更加丰富的碎片离子信息。对于分析过程中特征离子出峰情况不理想或不满足一级定性要求的疑似农药在最佳碰撞能下进行二级扫描,将分析物碎片离子信息与二级标准谱图作镜像对比,进而更加直观准确地对疑似农药加以确证。以环唑醇为例,所选取的母离子m/z为 222.0429,在碰撞能为10 eV时,获得实际样品中的二级谱图,通过与环唑醇标准谱图进行镜像对比(见图2),样品中所测得的目标物谱图与标准谱图匹配度极高,进一步确证了该农药化合物的存在。可见,GC-QTOF/MS对目标化合物的鉴别和确证能力更强。
气相色谱分析中,由于样品基质成分的存在,减少了色谱系统活性位点与目标分子作用的机会,使得目标分析物响应比纯溶剂中的色谱响应高,出现基质增强的效果。基质效应主要受以下几种因素影响:①样品前处理方法;②被分析农药的结构性质;③基质种类;④进样口、柱前段状态;⑤仪器选用的离子源及离子化形式等[22],因此,不同仪器之间会出现一定的偏差。
对于基质效应的评价,本文采用了较为常用的相对响应值法:基质效应=B/A×100%[23], A为纯溶剂中农药的响应值;B为样品基质中添加相同浓度农药的响应值。
本次研究配制了20 μ g/kg 的4种果蔬基质的基质标准溶液以及同浓度的溶剂标准溶液,对两种仪器的基质效应进行比较。基质效应值在80%以下视为强基质抑制效应,在80%～120%之间视为弱基质效应,在120%以上视为强基质增强效应。通过评价发现,208种农药中大多数农药在两种仪器中表现出基质增强效应(如图3所示)。对于GC-MS/MS,苹果、柑橘、番茄、黄瓜4种基质中表现为基质增强的农药所占比例分别为87.0% 、88.0% 、82.2% 、96.6% ;对于GC-QTOF/MS, 4种基质中表现为基质增强的农药所占比例分别为88.9% 、88.5% 、87.0% , 96.6% 。两种仪器的色谱部分、离子源、离子化部分的原理一致,因此两种仪器在4种基质中的基质效应整体趋势差别不大。由于基质效应明显,实验采用基质匹配校准曲线对样品中的农药残留进行定量,用以抵消基质效应的影响。
近年来,农药多残留检测技术迅猛发展,而农药多残留快速筛查技术已成为其重要的发展方向。GC-MS/MS和GC-QTOF/MS作为两种应用广泛的检测技术,在农药多残留检测方面发挥了不可替代的作用。但在快速筛查方面,两种仪器还存在一定的差异。
GC-QTOF/MS采用的全扫描模式可对设定的扫描质量范围内的所有物质进行测定,无需预先编辑质谱采集方法,扫描效率高,一针进样即可筛查几百种化合物,有效缩短了分析时间,可在短时间内对大量化合物进行分析,在对目标化合物分析的同时,也可对未知化合物进行筛查。在数据分析过程中,一次实验获得的数据可以进行多次分析以获得更多信息,而无需重新进行数据采集[24],节省了分析时间,因此在残留分析领域具有重要意义。
而GC-MS/MS由于受到驻留时间和扫描速度的限制,只能在特定时间段内检测有限的特定离子,对于本实验所研究的208种农药,为保证检测结果的准确,依据保留时间的不同编辑了4组采集方法进行数据采集;同时GC-MS/MS在样品分析前对待测物的质谱参数进行设定,限制了分析范围,忽略了潜在的非目标化合物,且通常需要标准品对照分析,增加了工作量与消耗。因此,在农药多残留快速筛查技术上,飞行时间质谱表现出了极大的优势。
为进一步考察两种仪器的检测能力,采用上述前处理方法对采自北京大型超市和农贸市场的市售32例水果、蔬菜样品(包括苹果、柑橘、黄瓜、番茄各8个),分别采用两种仪器进行检测。对检出结果进行分析发现,GC-MS/MS共检出12种农药残留,共计47频次;而GC-QTOF/MS共检出10种农药残留,共计35频次。两种仪器共同检出的农药有10种,35频次(如表2所示)。GC-MS/MS检出而GC-QTOF/MS未检出的农药有5种,12频次,将其检出浓度与相应的GC-QTOF/MS检出限进行对比,测得浓度均在GC-QTOF/MS检出限以下,这些农药的残留水平已超出GC-QTOF/MS的筛查能力,因此未能取得一致的检测结果。
GC-QTOF/MS的一个优点是筛查非目标化合物,采用GC-QTOF/MS的全扫描模式对实际样品进行测定,应用美国国家标准与技术研究所(NIST)农药库对测定结果进行检索,在黄瓜、番茄基质中分别发现了两种非目标化合物tricyclazole(三环唑)和cypermethrin(氯氰菊酯)(提取离子流图见图4),将这两种化合物的碎片离子与NIST库进行匹配,结果发现,主要碎片离子的种类和丰度均与NIST库中结果相一致,但也有个别离子的丰度由于基质的干扰而受到了影响,如氯氰菊酯中的离子m/z 181。通过推断出的碎片离子理论精确质量数,计算出三环唑和氯氰菊酯的精确质量偏差范围分别为0～3×10-6 (0～3 ppm)和8×10-6 ～1×10-5(8～10 ppm),更进一步确证了这两种化合物的存在。与NIST库匹配对比图如图5、图6所示。
研究表明,两种仪器在检测4种基质中208种农药残留方面都表现出了良好的准确性、稳定性和可靠性。GC-QTOF/MS在快速筛查和农药残留鉴别以及非目标化合物检测方面表现出突出优势;而GC-MS/MS定量能力更加准确稳定,其检出限和定量限明显低于GC-QTOF/MS,检测线性范围也更宽。两种仪器对4种基质中208种农药的检出限和定量限均能满足各国农药残留限量标准的要求。在农药多残留筛查过程中,可通过GC-QTOF/MS进行快速定性筛查,确定农药残留情况,然后对所检出农药进一步建立相应的采集方法，运用GC-MS/MS准确定量。这种筛查技术发挥了两种仪器各自的优势,可以显著提高农药多残留检测效率,减少了检测时间,有效避免假阳性结果的产生,提高了检测结果的可信度，从而提高我国在农药残留检测与监控中的技术水平。
2015, Vol. 33 Issue (4): 389-396
PDF (906 KB)
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