采用单分子光谱来研究色谱机理是目前色谱理论研究的前沿之一,Kisley和Landes两位学者最近就此写了一篇很好的综述^[1]。他们从单分子光谱的原理和仪器以及对所分析样品的要求出发,讨论了共聚焦显微镜、全内反射荧光成像分析等单分子光谱及其在色谱机理研究中的应用,所涉及的色谱方法包括反相色谱、正相色谱、离子交换色谱。分离科学与单分子光谱结合可以从分子水平上深入了解色谱过程,而这方面还有很多问题需要研究。目前,参加这方面研究工作的科学家并不多,但随着单分子光谱的发展,色谱理论的研究会有新的突破。

印第安纳大学的Jacobson教授组发表了一篇有趣的有关纳流控基础研究的综述^[2],总结了纳米尺度加工的进展以及纳流控基本原理和应用,内容包括纳米孔、纳米通道、纳米管、电动效应、双电层、电导率、电渗流、电泳、电势、离子流矫正、纳流控晶体管、浓度极化和样品富集、阻抗脉冲传感、纳流控分离与筛分、小体积传输、纳米电化学、电喷雾离子化等。对于相关领域的研究人员来说,这篇综述很值得一读。

纳米分析一般是指在纳米尺度上的分析,比如上文提到的纳米孔、纳米通道、纳米管中的分析。华东理工大学的龙亿涛教授组新近采用DNA发卡结构与聚乙二醇结合,提高了纳米孔中低相对分子质量聚乙二醇的分离度,实现了溶液中140 Da聚乙二醇的单分子检测^[3]。印第安纳大学的Jacobson教授组则是研究了纳米通道中的单颗粒电泳^[4],测定了在具有两个平行纳米孔的纳流控通道中乙型肝炎病毒(HBV)的电泳淌度和颗粒尺寸。所用的纳米孔为5 nm宽,45 nm深,400 nm长,两个纳米孔之间的通道为300 nm宽,100 nm深,2.5 μ m长。采用阻抗脉冲传感检测,可以分辨T(三角剖分数)=3(32 nm直径)和T=4(35 nm直径)的HBV衣壳,且有足够的峰容量可以区分T=3和T=4之间的病毒颗粒。因为T=3和T=4的HBV衣壳为中空球形结构,故所观察到的衣壳通过纳米孔时的电流变化与衣壳蛋白取代的电解质溶液体积(而不是整个衣壳的体积)成正比。脉冲振幅的信噪比以及T=3和T=4分布之间的分离度均随着电场强度的增加而增大。

整体柱是近年来液相色谱领域的研究热点之一。中国科学院大连化学物理研究所邹汉法教授组在整体柱的制备和应用上又有新的突破^[5]。他们采用光引发巯基-戊炔点击聚合法在紫外透明的石英毛细管中制备了聚合物整体柱,得到了0.5～1.0 μ m的均匀孔径,色谱柱的最小理论塔板高度为10.0～12.0 μ m。对蛋白质酶解产物的分析表明该类整体柱优于某些杂化整体柱,对酚类、天然产物以及标准蛋白质的分离效果也令人满意。

在联用技术的新进展方面,伊朗学者报道了薄层色谱(TLC)与离子淌度谱(IMS)的联用^[6]。以前有人尝试过多种在线联用接口,包括从TLC板的顶端直接电喷雾、从连接TLC板的针头间接电喷雾、将移动的溶剂转引入进样口等,效果均不理想。该文作者设计了一个专门的溶剂收集器,TLC板水平放置,溶剂可以流出;TLC板下方放置一个小漏斗收集溶剂并通过毛细管转移到喷雾针处,实现了在线联用,并成功分析了药物样品。其他方面的进展还有美国学者将流动分析中的混合器用于离子色谱的二维检测^[7];澳大利亚的Marriott教授组采用单离子液体固定液研究了全二维气相色谱观察到的特殊正交性,并用热敏感行为对其进行了解释^[8]。

样品制备新方法也是近年来一个研究热点,最近中山大学李攻科教授组采用溶剂热生长方法在多孔泡沫铜表面上生长金属有机骨架材料(MOF)-5,并用于植物挥发性硫化物的非侵入取样和富集^[9]。结果证明,具有三维孔道结构的MOF-5紧密附着在金属表面,在420 ℃时仍具有良好的热稳定性,且可重复使用200次以上。用此材料对几种植物中的挥发性硫化物顶空萃取后进行GC-MS分析,回收率、重复性和灵敏度均令人满意。河北农业大学的王志教授组则是用MOF材料一步碳化制备了磁性纳米多孔碳,并用于固相萃取,效果良好^[10]。固相微萃取的研究先驱加拿大Pawliszyn教授组报道了固相微萃取在生物体液中多不饱和脂肪酸的定量分析中的应用^[11]。

此外,韩国学者Kang和Shin博士报道了一种新的氰化物衍生化方法^[12],他们采用D-半胱氨酸和次氯酸盐在pH 4.5的条件下与氰化物于室温下反应10 min,就可以将氰化物衍生化为 β -硫氰丙氨酸,然后直接用LC-MS分析,检出限可达0.2 μ g/L 以下,该法可用于水中CN^-的测定。

蛋白组学和代谢组学等组学研究一直是色谱方法的重要应用领域,排泄物代谢组也已成为重要的研究方向之一。人类的排泄物样品含有内源性代谢物、肠道菌群代谢物和其他化合物,排泄物代谢组的分析所提供的代谢信息不仅可用于疾病代谢物的发现,而且有助于深入理解肠道菌群和人类健康的关系。浙江大学李兰娟教授组和加拿大阿尔伯特大学厉良教授组合作发展了一种用于人类排泄物中代谢物分析的高效化学同位素标记LC-MS方法,并将该方法用于排泄物样品中含胺和酚的代谢物分析^[13]。胺类和酚类的¹³C₂/¹²C₂-丹磺酰差别标记可以改善LC的分离效率和MS的检测灵敏度。他们采用水和乙腈顺序提取方法处理样品、梯度洗脱和飞行时间(TOF)-MS检测,分析了来自3个家庭的排泄物样品。经过243次LC-MS进样分析,一共检测到 6200 个代谢物峰,并经数据库比对鉴定了 3678 个峰,其中67个峰的归属用标准品进行了确证。这是迄今为止从人类排泄物中检测到数目最多的胺类和酚类代谢物,证明这一方法可用于排泄物代谢组学研究。此外,威斯康辛大学的李灵军教授组报道了用于定量蛋白组学研究的多重同位素标记新技术^[14]。

运动员体液中超痕量促红细胞生成素(EPO)的检测一直是反兴奋剂检测中的难题,随着各种EPO类似制剂的出现,原来采用单克隆抗体进行样品富集和分析的技术已不能满足要求。德国学者Thevis教授领导的研究组最近发展了受体涂层磁珠分离富集EPO的技术,并与LC-MS结合分离测定了3种类型的EPO(EPO zeta、darbepoetin alfa和C.E.R.A)^[15],检出限达到20～80 pg/mL,有望发展成为新的反兴奋剂检测方法。

人们一直认为除了微生物的细胞壁外,生物系统中不存在D型氨基酸。然而,科学家已经在老年人的不同组织中检测到了D-天冬氨酸,并证明蛋白质中D-天冬氨酸的形成会导致如阿兹海默症等老年疾病。要用色谱方法分离鉴定4种天冬氨酸异构体,必须合成含有这4种异构体的标准参比多肽。日本学者采用市售的酶结合LC-MS快速筛查了与疾病相关蛋白质中天冬氨酸的4种异构体^[16],这种方法不需要合成参比多肽。他们用4种酶解方法(胰蛋白酶、胰蛋白酶加Asp-N、胰蛋白酶加蛋白质L-异天冬氨酸甲基转移酶(PIMT)、胰蛋白酶加paenidase)处理蛋白质,所得多肽用LC-MS分析,根据多肽键不同的酶切位置可以区分不同的天冬氨酸异构体,这样就成功实现了4种天冬氨酸异构体的定性定量分析。这对老年疾病的生物标志物分析很有意义。

其他新的应用进展还有葡萄牙和德国学者合作发表了用GC-MS分析从RNA和DNA中分离得到的同位素异位体核苷的结果,并仔细研究了这些核苷的三甲基硅烷化衍生物的碎裂谱^[17]。德美法3国学者合作采用同位素稀释UPLC-MS/MS方法同时测定了人肺组织中的多种DNA加合物^[18]。

以上是色谱研究的一些最新成果举例,虽不能反映色谱研究进展的全貌,但还是表明了色谱发展的一些趋势。单分子光谱研究色谱分离机理可以深入了解色谱分离过程,对色谱分离优化和新的分离材料开发意义重大。样品处理常常是色谱分析的瓶颈问题,新型纳米材料以及整体材料在固相萃取和固相微萃取中的应用以及这些萃取技术与后续分离鉴定技术的在线联用无疑是一个活跃的研究领域。色谱在生命分析化学中的应用越来越广泛,特别是在各种组学分析中,色谱-质谱联用方法已成为必备手段,而且将会发挥越来越大的作用。