色谱  2015, Vol. 33 Issue (5): 545-550   PDF (805 KB)    
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王会锋
董小海
贾斌
冯书惠
刘进玺
钟红舰
固相萃取-气相色谱-串联质谱法测定大葱等蔬菜中23种邻苯二甲酸酯类化合物残留
王会锋, 董小海, 贾斌, 冯书惠, 刘进玺, 钟红舰     
河南省农业科学院农业质量标准与检测技术研究所, 农业部农产品质量监督检验测试中心, 农业部农产品质量安全风险评估实验室, 河南 郑州 450002
收稿日期：2014-12-23
基金项目：2014年国家蔬菜产品质量安全风险评估项目(GJFP2014001).
通讯作者：钟红舰,Tel:(0317)69069317,E-mail:80456811@163.com.
摘要：建立了气相色谱-串联质谱联用(GC-MS/MS)同时测定蔬菜中23种邻苯二甲酸酯类化合物(塑化剂)的方法。蔬菜经乙腈提取,玻璃Florisil固相萃取柱净化,正己烷定容,Agilent DB-5MS UI超高惰性毛细管柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm)程序升温分离,MS/MS(选择反应监测模式)分析,外标法定量。考察了大葱等复杂基质蔬菜中邻苯二甲酸酯类化合物的提取和净化方法,并对色谱和质谱条件进行了优化,提出了扣除本底的办法;通过基质加标校准曲线补偿对邻苯二甲酸酯检测的基质效应。23种邻苯二甲酸酯的线性范围除邻苯二甲酸二异壬酯(DINP)、邻苯二甲酸二异癸酯(DIDP)为0.1~5 mg/L外,其余均为0.02~1 mg/L,相关系数(r)除邻苯二甲酸二(2-甲氧基乙基)酯(DMEP)外均大于0.99。方法的检出限(S/N=3)为0.01~0.05 mg/kg,定量限(S/N=10)为0.02~0.1 mg/kg。3个加标水平下目标物的平均回收率为81.3%~104.2%,相对标准偏差(n=6)为3.2%~11.2%。该方法稳定可靠,应用串联质谱很好地消除了基质效应的干扰,灵敏度高,定性定量更为准确,适用于蔬菜中邻苯二甲酸酯类化合物的检测和确证。
关键词： 固相萃取     气相色谱-串联质谱     邻苯二甲酸酯     塑化剂     蔬菜    
Determination of 23 phthalate esters in scallion and other vegetables by solid-phase extraction coupled with gas chromatography-tandem mass spectrometry
WANG Huifeng, DONG Xiaohai, JIA Bin, FENG Shuhui, LIU Jinxi, ZHONG Hongjian     
Institute of Agricultural Quality Standards and Testing Technology, Henan Academy of Agricultural Sciences; Supervision and Test Center of Agricultural Product Quality, Ministry of Agriculture; Laboratory of Quality and Safety Risk Assessment for Agricultural Product, Ministry of Agriculture, Zhengzhou 450002, China
Received: 2014-12-23
Abstract: A method for the simultaneous determination of 23 phthalate esters in vegetables by solid-phase extraction coupled with gas chromatography-triple quadrupole mass spectrometry (SPE-GC-MS/MS) was developed and evaluated. The samples were extracted with acetonitrile, and cleaned-up with glass Florisil SPE columns, and diluted with n-hexane. The separation was performed on a DB-5MS UI capillary column (30 m×0.25 mm×0.25 μm) with temperature programming. The identification and quantification were performed by GC-MS/MS in selected reaction monitoring (SRM) mode. The external standard method was used. The processes of extraction and clean-up of scallion and other vegetables were investigated, and the chromatographic and MS parameters were optimized. The matrix effect was compensated by matrix spiked calibration. The extraction processes were investigated. The calibration curves of the phthalate esters showed good linearities in the ranges of 0.02-1 mg/L (0.1-5 mg/L for diisononyl phthalate (DINP) and diisodecyl-o-phthalate (DIDP)) with the correlation coefficients (r) over 0.99 except for bis(2-methoxyethyl) phthalate (DMEP). The limits of detection of phthalate esters in samples ranged from 0.01 to 0.05 mg/kg (S/N=3) and the limits of quantification ranged from 0.02 to 0.1 mg/kg (S/N=10). The average recoveries of the 23 analytes spiked in scallions ranged from 81.3% to 104.2% with the relative standard deviations (RSDs, n=6) of 3.2%-11.2%. The method is suitable for the determination of the 23 phthalate esters simultaneously in vegetables with easy operation, high accuracy and precision.
Key words: solid-phase extraction (SPE)     gas chromatography-tandem mass spectrometry (GC-MS/MS)     phthalate esters (PAEs)     plasticizers     vegetable    

邻苯二甲酸酯(phthalate acid esters,PAEs)是邻苯二甲酸与醇类形成的酯类的统称,又称酞酸酯,其作为增塑剂和软化剂广泛应用于生活和生产等数百种产品中[1]。塑料制品中的邻苯二甲酸酯遇到水、油脂等物质时会溶出,迁移扩散至环境中或渗入食品中[2]。目前对PAEs的毒性认识是急性毒性不大,但在大剂量累积的情况下对动物有致畸和致突变作用。PAEs已被视为内分泌干扰素或环境激素,会扰乱动物及人类的生殖发育系统[3]。中国环境监测总站和美国国家环境保护局(EPA)均将该类化合物列为优先控制污染物,EPA规定饮用水中邻苯二甲酸二(2-乙基己)酯(DEHP)的可容许残留值仅为6 μ g/kg。

蔬菜在大棚或者露天生产种植过程中大量暴露在PAEs的环境中:种子塑料包装出售,幼苗塑料地膜覆盖,生长在塑料温室大棚,土壤大气水中均存在塑化剂残留的可能;化肥、农药等基体中含有塑化剂被蔬菜吸收;另外蔬菜在销售终端会接触到塑料筐、塑料袋、塑料胶带等。这样,PAEs在蔬菜中逐渐地被吸收、迁移、富集。因此有必要对蔬菜中PAEs的残留量进行检测,为有关部门评价蔬菜的质量安全提供科学依据。

常见食品中PAEs的测定标准[4,5]和文献[6,7]没有明确涉及蔬菜;涉及蔬菜的文献[8,9,10]也只是对黄瓜、番茄、萝卜等比较干净的基质进行了测定,而对大葱等复杂基质的测定未见报道。塑化剂的测定方法最初为GC和LC方法[11,12],随后由GC(LC)-MS方法[13,14]向GC(LC)-MS/MS方法[15,16]发展,定性定量越来越准确。采用串联质谱与GC联用测定基质复杂的蔬菜中的多种塑化剂残留量,能较好地消除基质效应,灵敏度高,准确性好,可满足蔬菜质量安全风险评估的检测需要。本文前处理条件参照NY/T 761-2008[17]中农药的提取净化方法,建立的GC-MS/MS方法可对市场上常见蔬菜中23种塑化剂同时检测,大大提高了工作效率。

1 实验部分
1.1 仪器、试剂与材料


Trace GC Ultra气相色谱仪及TSQ Quantum GC三重四极杆质谱联用仪(美国Thermo Fisher公司),配电子轰击离子源(EI)和AI/AS 3000自动进样器;AUTOGIZER全自动均质仪(美国TOMTEC公司);旋转蒸发仪R-215(瑞士BUCHI公司); Milli-Q超纯水系统(美国Millipore公司)。

乙腈、丙酮、正己烷(色谱纯,美国J. T. Baker公司);氯化钠(分析纯,天津市科密欧化学试剂有限公司),140 ℃下烘烤4 h,冷却后捣碎置于玻璃瓶中备用;玻璃弗罗里硅土(Florisil)固相萃取柱(1 g/6 mL,月旭科技(上海)股份有限公司);实验用水为Milli-Q超纯水系统所制超纯水。所用玻璃器皿洗净后,用去离子水淋洗3次,于丙酮中浸泡1 h,在200 ℃下烘干2 h,冷却至室温备用。

23种邻苯二甲酸酯标准品(纯度均在95%以上,迪马科技(天津)有限公司):邻苯二甲酸二甲酯(DMP)、邻苯二甲酸二乙酯(DEP)、邻苯二甲酸二异丙酯(DIPrP)、邻苯二甲酸二烯丙酯(DAP)、邻苯二甲酸二丙酯(DPrP)、邻苯二甲酸二异丁酯(DIBP)、邻苯二甲酸二丁酯(DBP)、邻苯二甲酸二(2-甲氧基乙基)酯(DMEP)、邻苯二甲酸二异戊酯(DIPP)、邻苯二甲酸二(4-甲基-2-戊基)酯(BMPP)、邻苯二甲酸二(2-乙氧基)乙酯(DEEP)、邻苯二甲酸二戊酯(DPP)、邻苯二甲酸二己酯(DHXP)、邻苯二甲酸丁基苄基酯(BBP)、邻苯二甲酸二(2-丁氧基)乙酯(DBEP)、邻苯二甲酸二环己酯(DCHP)、DEHP、邻苯二甲酸二正庚酯(DHP)、邻苯二甲酸二苯酯(DPhP)、邻苯二甲酸二正辛酯(DNOP)、邻苯二甲酸二异壬酯(DINP)、邻苯二甲酸二异癸酯(DIDP)、邻苯二甲酸二壬酯(DNP);除DINP和DIDP的质量浓度为 5 000 mg/L,其余均为 1 000 mg/L。

供试样品为2013年和2014年农业部蔬菜质量安全风险评估任务所抽取的蔬菜生产基地、批发市场、农贸市场、超市等26个品种400余份的新鲜蔬菜样品。

1.2 标准工作液的配制

准确吸取PAEs标准溶液1.0 mL,用正己烷溶解并定容于25.0 mL容量瓶中,配制成40～200 mg/L 的标准储备液,于-18 ℃冰箱中避光保存。使用前根据需要,将标准储备液用正己烷或者阴性基质溶液稀释至合适浓度,配制成系列标准溶液。

1.3 样品提取和净化

准确称取25.0 g样品放入匀浆瓶中,加入50.0 mL乙腈,用全自动均质仪高速匀浆1 min,抽滤于装有6～7 g氯化钠的具塞量筒中,收集滤液40～50 mL,盖上塞子,剧烈振荡1 min,在室温下静置30 min以上,使乙腈相和水相分层。

从具塞量筒中吸取5.0 mL乙腈相溶液于100 mL梨形瓶中,旋转蒸发至近干,加入2 mL正己烷溶解,待净化。

将玻璃Florisil柱依次用5 mL正己烷-丙酮(90 ∶ 10,v/v)、5 mL正己烷预淋洗活化柱;当溶剂液面到达吸附层上沿时,立即倒入上述待净化溶液,用另一个100 mL梨形瓶接收洗脱液,并用15 mL正己烷-丙酮(90 ∶ 10,v/v)分3次淋洗装待净化液的梨形瓶,倒入Florisil柱内;将接收到的淋洗液旋转蒸发至近干,用正己烷溶解并定容至2.0 mL,待测。

1.4 GC-MS/MS条件
1.4.1 GC条件

色谱柱:DB-5MS UI毛细管柱(30 m×0.25 mm×0.25 μ m,美国安捷伦J&W公司);载气:氦气(纯度99.999% ),恒流模式,流速1.0 mL/min;进样口温度:250 ℃;进样量:1.0 mL;进样方式:不分流进样;不分流时间:2.0 min;柱温升温程序:初始温度80 ℃(保持1.0 min),以10 ℃/min 升至150 ℃,再以5 ℃/min 升至200 ℃(保持3 min),再以4 ℃/min 升至250 ℃(保持3 min),再以20 ℃/min 升至310 ℃(保持5 min),总运行时间为44.5 min。

1.4.2 MS/MS条件

电离模式:电子轰击;电离能:70 eV;灯丝电流:30 μ A;离子源温度:250 ℃;传输线温度:280 ℃; Q2碰撞气:氩气(纯度99.999% );碰撞池压力:0.2 Pa;溶剂延迟时间:5 min;扫描方式:选择反应监测模式(SRM)。Easy(EZ)-method:分辨率(FWHM): 0.7 Da;扫描时间(cycle time): 0.3 s；监测窗口(time window):除DINP和DIDP为5 min,其余均为1 min; 23种邻苯二甲酸酯类化合物的保留时间及质谱条件见表1。Xcalibur 2.1工作站软件用于仪器控制和数据处理。

表1 23种邻苯二甲酸酯类化合物的保留时间及SRM模式下的MS/MS条件 Table 1 Retention times and MS/MS conditions of the 23 PAEs in SRM mode
2 结果与讨论
2.1 方法的选择

GC-MS/MS(SRM)比GC-FID、GC-MS(SIM)能力更强:第一,抗复杂基质干扰,能消除基质效应影响,灵敏度高;第二,对于出峰重合且特征离子相近的化合物,能通过不同离子对定性,可排除假阳性;第三,具有高通量的分析能力,可一针进样同时分析农药及兽药、塑化剂和多环芳烃等不同种类化合物。因此面对复杂基质且保留时间接近的几十种PAEs的痕量分析,选择GC-MS/MS(SRM)方法更为适合。

2.2 系统本底的控制

在样品中PAEs的检测过程中不可避免地会引入外来的PAEs,因此对检测过程中PAEs本底值的控制和系统评价很有必要。所用的有机试剂首选为色谱纯,无机试剂需要经过高温烘烤,玻璃器皿要经水洗后再用丙酮清洗。另外,检测过程中尽量避免使用塑料制品。为了准确了解外来迁入PAEs的情况,每批次样品需做3个空白,取其平均值作为系统本底值。通过测定,本实验室的系统空白(见图1b)约为0.01 mg/kg,约为方法的检出限,故PAEs的本底值可以忽略不计。

图1 (a)大葱基质加标样品(0.20 mg/kg)、(b)系统空白和(c)阳性大葱样品的总离子流图 Fig.1 Total ion current chromatograms of the 23 phthalate esters in (a) a scallion sample spiked at 0.20 mg/kg,(b) test blank and (c) a positive scallion sample The peak Nos. are the same as in Table 1.
2.3 提取和净化方法的选择

为了同时测定蔬菜中的23种塑化剂残留,参考了现有标准[4, 5, 17, 18]和相关文献[9],首先确定以乙腈作为提取溶剂,样品加入乙腈均质后清澈不易乳化,加盐脱水时提取液分层容易。

样品净化可以减少基质效应和维持仪器灵敏度。凝胶渗透色谱(GPC)净化对高油脂样品十分有效[5],但仪器的部件多是塑料制品,塑化剂本底值较高。SPE对蔬菜水果的净化效果较好。郑向华等[6]发现石墨化氨基碳柱和氨基柱对塑化剂吸附强,加标回收率几乎为零;C18柱对DHP、DPhP、DNOP、DIDP、DIDP、DNP 6种被测物吸附较强,加标回收率均小于50% 。本文借鉴王明林等[8]、孙欣等[9]、孙若男等[10]和李红等[19]对测定PAEs净化材料的研究,选择玻璃Florisil柱作为净化柱，考察了正己烷-丙酮(90 ∶ 10,v/v)的淋洗体积为15 mL时,PAEs的回收率均大于80% ,可满足实验要求。

最终确定了本实验的提取净化条件为乙腈提取,Florisil玻璃柱净化,15 mL正己烷-丙酮(90 ∶ 10,v/v)淋洗。

2.4 仪器条件优化

PAEs是一类含有苯环的极性较弱的化合物,部分化合物的沸点较高,因此色谱柱应选用非极性或弱极性的固定相。本文选择DB-5MS UI毛细管柱(30 m×0.25 mm×0.25 μ m)作为分离色谱柱。本实验获得的部分邻苯二甲酸酯类化合物的保留时间顺序为:tRBMPP＜tRDIPP,tRDHXP＜tRBBP,tRDPhP＜tRDHP＜tRDEHP(见图1a和表1),与其他文献[6, 7, 20, 21, 22]报道的顺序tRDEHP＜tRDHP＜tRDPhP有所差异,推测是同型号不同色谱柱间存在的细微差异造成的。

本实验的质谱条件是在参考文献[9, 15, 21, 22, 23]或者仪器公司提供的参考条件基础上,大致寻找出组分出峰时间和SRM条件,应用在本实验室的仪器上,同时放大监测窗口宽度(3～5 min),寻找出准确的保留时间和合适的离子对(母离子和子离子)及其碰撞能量。由于塑化剂的特征离子极其相似,可以选择一对定量离子、两对定性离子进行分析,质谱条件见表1。在优化条件下得到的23种PAEs的总离子流色谱图见图1a。

2.5 方法的线性关系和灵敏度

本研究采用外标法进行定量,以目标物的质量浓度为横坐标,定量离子对响应峰面积为纵坐标建立标准曲线,线性范围除DINP和DIDP为0.1～5.0 mg/L 外,其余均为0.02～1.0 mg/L。溶剂标准曲线和大葱基质加标标准曲线的相关系数见表2,线性相关系数除DMEP外均高于0.99。

表2 23种PAEs的溶剂标准曲线和基质加标标准曲线的相关系数、检出限和定量限 Table 2 Correlation coefficients of solvent spiked calibration and matrix spiked calibration,limits of detection and limits of quantification of the 23 PAEs

在本方法仪器条件下,按S/N=3确定方法的检出限(LOD)为0.01～0.05 mg/kg,按S/N=10确定方法的定量限(LOQ)为0.02～0.1 mg/kg。

2.6 方法的准确度和精密度

为了验证方法的准确度,在大葱基质中进行了加标回收试验,其中DINP和DIDP的加标水平均为0.25、0.5、5.0 mg/kg,其余PAEs的加标水平均为0.05、0.1、1.0 mg/kg。每一加标水平分别做6份平行试样,计算平均回收率和相对标准偏差(RSD)。大葱基质中的加标回收试验结果见表3,可见23种PAEs的加标回收率范围为81.3% ～104.2% ,RSD为3.2% ～11.2% ,其准确度和精密度满足分析要求。

表3 大葱中23种PAEs的加标回收率及相对标准偏差(n=6) Table 3 Recoveries and relative standard deviations (RSDs) of the 23 PAEs spiked in scallion (n=6)
2.7 基质效应

分别考察了纯溶剂校准曲线方程和基质加标校准曲线方程对加标样品的校正情况。结果发现,纯溶剂校准曲线方程校正平均回收率为65% ～155% ,基质加标校准曲线方程校正平均回收率为81.3% ～104.2% 。因此选择基质加标标准工作曲线作为校正曲线,能很好地消除基质效应带来的偏差。

2.8 实际样品分析

2013年9月以来,本实验室采用本文方法对400多个蔬菜样品进行了PAEs风险监测。结果显示,蔬菜中PAEs检出率在50%以上,其中DEHP、DIBP、DBP的检出率最高,DEHP检出含量为0.02～6.31 mg/kg;普通白菜、芹菜等蔬菜容易迁移吸收PAEs,大葱样品也检测出多种塑化剂(见图1c)。

3 结论

本文建立了SPE-GC-MS/MS(SRM)测定蔬菜中23种PAEs的方法,其灵敏度、精密度、准确度均能满足日常检测分析要求,适用于蔬菜中多种塑化剂残留量的测定,尤其是对葱、姜、蒜、韭菜等复杂基质蔬菜,能较好地消除基质效应,具有快速、灵敏度高的特点,定性定量更为准确。

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