全氟烷基酸(perfluoroalkyl acids,PFAs)是烷基链上的氢原子全部被氟原子取代,化学通式为F(CF2)n-R,其中R为一类人工合成的含有亲水官能团的有机氟化物,有优良的疏水、疏油性及独特的物理及化学性质，被广泛应用于表面防污处理剂、中间体、医药、包装材料等领域[1,2]。研究表明,全氟烷基酸具有肝脏中毒、神经中毒、胚胎发育中毒等生物毒性,可以在食物链中富集放大,具有生物积累性[3,4,5]。环境调查发现,在全球范围内的生态环境系统、动物体和食品中均广泛存在PFAs污染[6,7,8,9]。Sedlak等[2]对旧金山的鸡蛋、鱼和海豹血清中PFAs含量进行调查,发现全氟辛烷磺酸钠(PFOS)是主要的全氟烷基酸。胡国成等[10]对珠江三角洲的土壤进行检测,结果表明土壤中全氟辛酸(PFOA)、PFOS普遍存在。研究表明,动物源食品的摄入量与人体血液中PFAs的含量有相关性[11],且PFAs容易在动物肝脏内富集[12],因此有必要建立动物肝脏中PFAs的残留检测方法。
目前,动物源性食品中PFAs的分析方法已有报道,国内外在PFAs的检测方面,常使用高效液相色谱-串联质谱联用技术(HPLC-MS/MS)[13,14]。在动物源样品前处理方面,样品提取前先用酸、碱或离子对等试剂使PFAs完全离子化,然后再对样品中的PFAs进行萃取。常用的萃取方法有离子对试剂法[15]、碱消解法[16]、酸化乙腈萃取法[17]。常结合固相萃取技术对样品进行进一步净化,如采用WAX弱阴离子交换萃取柱、HLB固相萃取柱、C18反相固相萃取柱等固相萃取柱进行净化[15,18]。但这些方法工序复杂、操作繁琐,不利于大量样品的分析检测。QuEChERS法最先于2003年应用于水果和蔬菜中的多残留检测[19],近年来在国际上发展起来。用于农药残留检测的分散固相萃取方法利用吸附剂填料与基质中的杂质相互作用达到净化除杂的目的。与固相萃取柱净化法相比,QuEChERS法具有简单、快速、经济、便捷等优点。目前,QuEChERS法已广泛应用在不同领域的检测分析且不断更新,在食品中的分析已多见报道,如检测食品基质中的农药残留[20,21]、鸡肉中的金刚烷胺[22]。对于动物源样品中PFAs的含量检测,郭萌萌等[17]用QuEChERS法分析了水产品中23种PFAs,检出限为0.002～0.02 μ g/kg;李静等[23]采用QuEChERS法分析了鸡蛋中的16种PFAs,检出限为0.001～0.093 μ g/kg。目前,采用QuEChERS前处理技术分析羊肝中PFAs含量的检测方法尚未见报道。
羊肝样品的分析受内源性杂质干扰、含量低等因素的影响。本研究通过改进已有的分析方法[16,17],采用酸化乙腈提取,加入乙二胺-N-丙基硅烷(N-propylethylenediamine,PSA)、C18、石墨化炭黑(graphitized carbon black,GCB)净化除杂,建立了羊肝样品中19种PFAs的HPLC-ESI-MS/MS分析方法。
Agilent Technologies 1290型高效液相色谱仪(美国Agilent公司)和AB SCIEX QTrap 5500型四极杆质谱仪(美国AB公司);低温高速离心机(德国Sigma公司);氮吹浓缩仪(美国Caliper公司); Milli-Q高纯水发生器(美国Millipore公司);微孔有机滤膜(0.22 μ m,德国Origin公司)。
甲醇、乙腈为色谱纯;浓盐酸、乙酸铵、氯化钠、PSA、C18、GCB为优级纯。混合外标标准溶液(2000 μ g/L):全氟丁基磺酸盐(PFBS)、全氟戊烷磺酸钠(PFPeS)、全氟己烷磺酸钠(PFHxS)、全氟庚烷磺酸钠(PFHpS)、全氟辛烷磺酸钠(PFOS)、全氟壬烷磺酸钠(PFNS)、全氟癸烷磺酸钠(PFDS)、全氟十二烷磺酸钠(PFDoS)、全氟戊酸(PFPeA)、全氟己酸(PFHxA)、全氟庚酸(PFHpA)、全氟辛酸(PFOA)、全氟壬酸(PFNA)、全氟癸酸(PFDA)、全氟十一烷酸(PFUdA)、全氟十二烷酸(PFDoA)、全氟十三烷酸(PFTrDA)、全氟十四烷酸(PFTeDA)、全氟十六烷酸(PFHxDA)。混合内标标准溶液(2000 μ g/L):13C2-PFHxA、18O2-PFHxS、13C4-PFOA、13C4-PFOS、13C5-PFNA、13C2-PFDA、13C2-PFUdA和13C2-PFDoA。混合外标和内标溶液均购自加拿大Wellington Laboratories公司。羊肝样品为市售。
色谱柱:Agilent Poroshell 120 EC-C18柱(100 mm×2.1 mm,2.7 μ m)(美国Agilent公司);柱温:35 ℃;进样量:10 μ L;流动相:5 mmol/L NH4Ac甲醇溶液(A)和5 mmol/L NH4Ac水溶液(B);梯度洗脱程序:0～3 min,90%A～30%A; 3～13 min,30%A～0%A; 13～14 min,0%A～90%A; 14～20 min,90% A。流速:200 μ L/min。
质谱仪检测所用气体为氮气。电喷雾电离负离子模式(ESI-),MRM扫描方式;分辨率:单位分辨率;气帘气压力:0.24 MPa;碰撞气压力:0.021 MPa;电喷雾电压:-2000 V;离子源温度:375 ℃;雾化气压力:0.34 MPa;辅助气压力:0.24 MPa。分别扫描离子对Q1和Q3,优化的解簇电压(declustering potential,DP)和碰撞能量(collision energy,CE)等参数见表 1。
称取羊肝均质样品2 g(精确到0.01 g),置于50 mL具螺旋盖聚丙烯(polypropylene,PP)离心管中,加入20 μ L 50 μ g/L 混合内标标准溶液和2 mL超纯水,漩涡混合2 min后,加入10 mL 30 mmol/L 盐酸的乙腈溶液,振摇10 min后,加入2 g NaCl,再次振摇10 min,以 13000 r/min 速率离心5 min。取上清液(约10 mL)于另一15 mL PP离心管中,40 ℃下氮气吹浓缩至约4 mL,乙腈定容至4 mL。漩涡混合均匀后,将上清液(乙腈层)转移至装有100 mg PSA、80 mg C18和40 mg GCB吸附剂的15 mL PP离心管中,充分富集净化后,以 13000 r/min 速率离心10 min,取上清液(约4 mL)于另一15 mL PP离心管中,40 ℃下吹氮气浓缩至约0.5 mL,乙腈定容至1 mL,以 13000 r/min 速率离心10 min,提取上清液过0.22 μ m有机滤膜,滤液供HPLC-MS/MS分析。
样品前处理采用液液萃取结合基质分散固相萃取净化方法(QuEChERS法)。文献[17]选用甲酸-乙腈共萃取,C18、GCB为吸附剂净化提取液,采用超快速液相色谱-串联质谱法(UFLC-MS/MS) 检测水产品中PFAs含量。针对羊肝样品基质复杂、干扰大等特点,需要更有效的提取净化方法。本研究采用改良的QuEChERS样品前处理方法,选用盐酸-乙腈共萃取,PSA、C18、GCB混合吸附剂萃取净化,以减少基质中的杂质干扰，提高净化效果。
PSA含有伯胺和仲胺基团,具有弱的阴离子交换能力,可以吸附糖类、脂肪酸、碳水化合物、酚和少量色素等杂质。PSA为碱性填料,对酸性待测目标物有吸附作用。考察不同PSA用量对19种PFAs 加标回收率的影响,结果如图 1所示。随着PSA用量的增加,目标化合物的回收率呈上升趋势,并在100 mg时回收率达到最大值;当PSA用量超过100 mg时,除PFDA、PFHpS、PFOS、PFDoS的回收率略有上升外,其余PFAs的回收率反而下降,故选择100 mg PSA为最佳用量,这与Lehotay等[24]报道的不同PSA用量下PFAs加标回收率的结果相符。在此基础上,发现用量为80 mg C18、40 mg GCB可以有效去除脂肪、色素、醇类等杂质,总体回收率为80% ～120% ,净化液清澈透明(见图 2)。因此本方法最终选择100 mg PSA、80 mg C18、40 mg GCB混合吸附剂为净化提取液的最佳用量。
实验考察了盐酸浓度不同(15、30、60、120和240 mmol/L)时羊肝样品中19种PFAs的加标回收率。结果发现，在考察的浓度范围内，除PFUdA的回收率随盐酸浓度的增加而下降外，其他18种PFAs的回收率随盐酸浓度的增加而增加，且在盐酸浓度为30 mmol/L 时达到最大值。
部分长链PFAs如PFDoA、PFTrDA、PFTeDA在盐酸浓度高于30 mmol/L 时加标回收率随着盐酸浓度的增加下降明显。故选择30 mmol/L 盐酸为最佳浓度。图 3为优化条件下空白羊肝基质匹配标准溶液的定量离子色谱图。
为了减少实验过程中引入PFAs污染,降低背景干扰,文献[25]建议色谱系统的管路应为聚醚醚酮(PEEK)管路和不锈钢管路,全过程尽量避免使用聚四氟乙烯器皿。同时样品在分析过程中需要做流程空白来监测背景污染。流程背景的测定方法:用2 mL Milli-Q超纯水替代样品,后续操作按照1.3节进行全程处理。流程背景值包括仪器背景值。
PFAs在非PP材质离心管中广泛存在,使用非PP材质离心管时会引入PFHxA、PFNA和PFOS背景干扰(见图 4),因此样品前处理过程使用的离心管均为PP材质。
用空白羊肝基质溶液配制成0、0.05、0.1、0.2、0.5、1.0、2.0、5.0、10.0和20.0 μ g/kg 的混合全氟烷基酸标准溶液,其中内标标准溶液的含量为1.0 μ g/kg,用于内标法定量分析,建立羊肝中19种PFAs与内标物定量离子的峰面积比和目标物与内标物的含量比的关系,各分析物的线性相关系数见表 2。结果表明,本方法在0.05～20.0 μ g/kg 范围内线性关系良好;实际样品中19种PFAs的检出限(S/N=3)为0.004～0.111 μ g/kg,定量限(S/N=10)为0.012～0.370 μ g/kg。
在空白羊肝样品中添加19种PFAs标准溶液,加标水平分别为0.5、1.0和2.0 μ g/kg,每个浓度点平行测定6次,内标法定量,采用本方法进行加标回收率实验。结果如表 3所示,在添加水平范围内19种PFAs的平均回收率为80% ～128% ,相对标准偏差为0.31% ～11.1% 。
采用优化的样品前处理方法和分析条件分别对随机采集的15份羊肝样品进行分析。结果表明,15份羊肝样品中均不同程度地含有PFAs,羊肝样品中PFOA、PFNA和PFDA的检出率高达70%以上,含量范围分别为0.097～0.535 μ g/kg、0.083～0.180 μ g/kg、0.065～0.118 μ g/kg,并含有痕量的PFPeA、PFHpA、PFHxA、PFUdA、PFPeS、PFOS和PFDS,其余9种PFAs未检出。
本文建立了QuEChERS法结合HPLC-MS/MS技术测定羊肝样品中19种PFAs残留的检测分析方法。该方法的线性关系、准确度和精密度均能满足残留分析要求,其前处理方法简单、净化效果良好,适用于大量羊肝样品中PFAs含量的快速检测。
2015, Vol. 33 Issue (5): 494-500
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