色谱  2015, Vol. 33 Issue (4): 413-418   PDF (1073 KB)    
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陈心悦
柳小亚
陈亚丽
洪妍
封士兰
红芪药材防治肝纤维化的谱效关系
陈心悦, 柳小亚, 陈亚丽, 洪妍, 封士兰     
兰州大学药学院, 甘肃 兰州 730000
收稿日期：2014-12-29
基金项目：甘肃省科技支撑计划项目(1304FKCA101).
通讯作者：封士兰, E-mail: fengshl@Lzu.edu.cn.
摘要：研究了红芪药材的高效液相色谱(HPLC)指纹图谱与抗肝纤维化作用之间的谱效关系。采用四氯化碳(CCl4)-花生油(体积比为4:6)皮下注射(0.1 mL/10 g, 1次/5 d)致小鼠肝纤维化,同时灌胃给予红芪各不同溶剂提取物(10 g原药材/kg, 1次/d), 5周后测定与肝纤维化有关的各血清指标及肝重指数,结果乙醇提取物药效最佳。运用灰色关联度和偏最小二乘法研究了不同产地红芪药材乙醇提取部位的HPLC指纹图谱与抗肝纤维化药效之间的谱效相关性。结果红芪乙醇提取物中多数成分与抗肝纤维化药效均有高度关联性(>0.8),表明该药效是红芪中所有成分共同作用的结果;同时鉴定出腺苷、毛蕊异黄酮及芒柄花苷3种成分,其中腺苷及毛蕊异黄酮对药效有较大贡献。
关键词： 指纹图谱     肝纤维化     谱效相关     统计方法     红芪    
Spectrum-effect relationship on anti-hepatic fibrosis effect of Radix Hedysari
CHEN Xinyue, LIU Xiaoya, CHEN Yali, HONG Yan, FENG Shilan     
College of Pharmacy, Lanzhou University, Lanzhou 730000, China
Received: 2014-12-29
Abstract: The spectrum-effect relationship on anti-hepatic fibrosis effect of Radix Hedysari was explored based on high performance liquid chromatographic technique. Hepatic fibrosis was induced in mice by administering a subcutaneous injection of carbon tetrachloride-peanut oil (4:6, v/v) continuously for 35 d at a interval of 5 d (0.1 mL/10 g). And at the same time of modeling, the different extracts of Radix Hedysari were administered orally once daily at a dose of 10 g/kg. The ethanol extract of Radix Hedysari was specified to be most effective on anti-hepatic fibrosis by determining the levels of alanine aminotransferase, aspartate transaminase, total-protein, albumin, albumin/globulin (ALT, AST, TP, ALB, and A/G) in serum and relative liver weight. Subsequently, the grey relational degree analysis and partial least squares analysis were employed to reveal the correlation between chromatographic fingerprint of ethanol extract of Radix Hedysari from 10 different geographical origins and its anti-hepatic fibrosis efficacy. The results suggest that most chemical constituents of Radix Hedysari have a high correlation with the effect of anti-hepatic fibrosis (>0.8), which indicates that the effect is related to the various components in Radix Hedysari. Adenosine, calycosin and ononin in ethanol extract of Radix Hedysari have been identified separately among which adenosine and calycosin made the great contribution to the anti-hepatic fibrosis effect.
Key words: fingerprints     hepatic fibrosis     spectrum-effect relationship     statistical method     Radix Hedysari    

中药谱效相关研究是近年来发展的探究药效物质基础、有效控制中药质量的新方法,它在中医药理论现代研究的基础上,以中药指纹图谱为基础,以效应学为主要内容,运用统计的方法(聚类分析、主成分分析、回归分析、灰色关联度分析等),将中药指纹图谱中化学成分的变化与中药的药效关联起来[1]。

红芪(Radix Hedysari)也称为“独根”,是豆科植物多序岩黄芪(Hedysarum polybotrys Hand. Mazz.)的干燥根。红芪性微温、味甘,归肺、脾经,具有补气升阳、固表止汗、利水消肿、生津养血等功效[2]。其化学成分主要有多糖[3]、黄酮[4]、皂苷[5]、微量元素及氨基酸[6]。胡芳弟等[7]利用HPLC测定了红芪中两种异黄酮类成分的含量;邵晶等[8]利用双波长薄层扫描法测定了红芪颗粒剂中 γ -氨基丁酸的含量;关于红芪多糖的测定,目前报道有蒽酮-硫酸分光光度法[9]、HPLC-蒸发光散射检测器(ELSD)检测法[3];而对于红芪根中微量元素和氨基酸的测定,早在上世纪90年代已有报道[6]。

柳姜冰等[10]研究证实了红芪多糖对D-氨基半乳糖所致大鼠肝损伤及四氯化碳所致小鼠肝损伤具有保护作用,但关于红芪发挥该疗效的物质基础并未研究。为此,本研究以四氯化碳-花生油(体积比为4 ∶ 6)溶液造成小鼠肝纤维化,将红芪的HPLC指纹图谱与药效学实验相结合,运用灰色关联度及偏最小二乘的方法研究两者之间的谱效关系,以揭示其药效物质基础。

1 实验部分
1.1 仪器、试剂与材料

Waters Alliance 2695-高效液相色谱仪,包括2996-二极管阵列检测器、717自动进样器和Millennium 32-色谱工作站(美国Waters公司);中南大学中药色谱指纹图谱计算机辅助相似性评价软件(11.0);旋转蒸发仪(N-1100,东京理化器械[株]独资工厂);涡旋混匀器(XK96-B,姜堰市新康医疗器械有限公司); 550酶联免疫检测仪(美国Bio-Rad公司);超声波清洗器(KQ3200BE数控,昆山市超声仪有限公司); Sartorius BP211D电子天平(误差±0.000 01 g,德国赛多利斯); FA2104电子天平(误差±0.000 1,上海市安亭电子仪器厂)。

乙腈(分析纯,Merck公司);娃哈哈纯净水;对照品芒柄花苷(批号:201206,购自中国药品生物制品检定所,纯度＞98% );对照品腺苷(批号:110879-200202,购自中国药品生物制品检定所,纯度＞98% );对照品毛蕊异黄酮(购自上海顺勃生物工程有限公司,纯度＞98% );秋水仙碱片(批号:140505,西双版纳药业有限责任公司,规格0.5 mg/粒);四氯化碳(CCl4,天津市富宇精细化工有限公司);花生油(山东鲁花集团有限公司);谷草转氨酶试剂盒(ALT)、谷丙转氨酶试剂盒(AST)、总蛋白试剂盒(TP)、白蛋白试剂盒(ALB)(均购自南京建成生物制药公司); 10批甘肃省不同产地红芪药材,自采或购买,编号及来源见表 1。经兰州大学生药学研究院马志刚教授鉴定为多序岩黄芪Hedysarum polybotrys Hand. Mazz.的干燥根。

表 1 红芪药材来源 Table 1 Sources of Radix Hedysari

昆明种小鼠,雄性,体重18～25 g,兰州大学动物实验中心提供,合格证号:SCXK(甘)2013-0002。

1.2 红芪不同提取部位的制备[11]

称取红芪(编号9)500 g,每次加入6倍量的95%乙醇回流提取1 h,3次后,合并提取液,减压蒸馏至无醇味,取其中1/5浓缩至干,得红芪总提取物;剩余4/5移至分液漏斗,加入等体积的石油醚萃取5次,合并上层萃取液,浓缩至干,即为石油醚提取部位;下层液体加入等体积乙酸乙酯萃取,方法同石油醚提取部位,即得乙酸乙酯提取部位;经两次萃取后剩余溶液浓缩至干,加入乙醇,能溶于其中的即为乙醇提取部位;回流提取后的红芪药渣加热水提取3次,每次1 h,合并提取液,减压浓缩后离心,取上清液,加入乙醇得到的沉淀部分即为红芪粗多糖部分。按照该步骤,依次得到红芪总提取物、石油醚部位、乙酸乙酯部位、乙醇部位和红芪粗多糖(表 2中分别以序号1、2、3、4、5来依次表示各提取部位),根据各提取部位的出膏率换算小鼠的给药剂量。

1.3 红芪不同提取部位的抗肝纤维化作用[12, 13]

取雄性昆明种小鼠96只,适应性饲养一周后,随机分为空白组、模型组、阳性对照组和5个红芪提取部位给药组,每组12只。模型组皮下注射四氯化碳-花生油(体积比为4 ∶ 6)溶液诱发肝纤维化,0.1 mL/10 g(首剂加倍),1次/5 d,连续35 d,即可形成肝纤维化。除空白组外,其余各组均按模型组同法造模。造模同时阳性对照组灌胃给予秋水仙碱片(0.6 mg/kg),5个给药组灌胃给予各自提取部位(10 g原药材/kg),空白组和模型组均给予生理盐水,剂量同上。末次给药后,摘眼球取血,静置离心后,分离出血清,按试剂盒说明测定ALT、AST、Tp、Alb、A/G各项指标[14];同时摘除小鼠肝脏,称重,计算肝重指数[15]。结果见表 2。

表 2 红芪不同提取部位对四氯化碳致小鼠肝纤维化的影响(n=12) Table 2 Effect of different extracts of Radix Hedysari on carbon tetrachloride-induced hepatic fibrosis in mice (n=12)
1.4 不同产地红芪乙醇提取部位的抗肝纤维化作用

取10批不同产地红芪,按1.2节步骤制备乙醇提取部位。取雄性昆明种小鼠156只,随机分为空白组、模型组、阳性对照组和10批红芪乙醇提取部位给药组,每组12只。各组实验方法和周期均同1.3节。结果见表 3。

表 3 不同产地红芪乙醇提取部位对四氯化碳所致小鼠肝纤维化的药效指标(n=12) Table 3 Effect of ethanol extract of Radix Hedysari from 10 different sources on carbon tetrachloride-induced hepatic fibrosis in mice (n=12)
1.5 不同产地红芪乙醇提取部位的HPLC指纹图谱
1.5.1 色谱条件

Spursil C18色谱柱(250 mm×4.6 mm,5 μ m);流动相:A为乙腈,B为水;梯度洗脱:0～40 min,40%A; 40～75 min,60%A;检测波长为260 nm;流速为1.0 mL/min;柱温为25 ℃;进样量为20 μ L。

1.5.2 对照品溶液的制备

精密称量腺苷对照品、毛蕊异黄酮对照品、芒柄花苷对照品适量,加甲醇分别制成适当浓度的对照品溶液。

1.5.3 供试品溶液的制备

取10批红芪药材乙醇提取部位的干燥品各0.5 g,精密称定,加甲醇溶解并转移至10 mL量瓶中,加甲醇稀释至刻度,摇匀,滤过,取续滤液,即得。

2 结果与讨论
2.1 红芪不同提取部位的药效学研究

由表 2可知,红芪总提取物与模型组相比,各指标均无显著性差异;石油醚部位与模型组相比,仅AST指标与模型组相比有显著性差异,其余5项指标与模型组相比均无显著性差异;同理,乙酸乙酯部位虽有两项指标(ALT,ALB)与模型组相比表现出显著性差异,但另4项指标与模型组相比均无显著性差异;红芪乙醇提取部位及红芪多糖对四氯化碳致小鼠肝纤维化有明显的抑制作用,与模型组相比,6项指标均具有显著性差异(p＜0.001,p＜0.01)。而本实验室[16, 17, 18]已研究了红芪多糖的提取分离及组成结构,已获得红芪多糖(HPS-1,HPS-2,HPS-3),经气相色谱、薄层色谱及红外光谱分析,确定了3种红芪多糖均由鼠李糖、阿拉伯糖、木糖、葡萄糖、半乳糖5种单糖组成,并进行了含量测定。而红芪乙醇提取部位的研究暂未涉及,因此本工作选择红芪乙醇提取部位进行HPLC指纹图谱与抗肝纤维化作用之间的谱效关系研究。

2.2 不同产地红芪乙醇提取部位的抗肝纤维化作用

从表 3可以看出,10批不同产地红芪与模型组相比,综合6个指标来看,大部分指标均具有极显著性差异(p＜0.001),说明造模成功,药效显著。

2.3 不同产地红芪乙醇提取部位的HPLC指纹图谱
2.3.1 色谱峰归属

分别精密吸取腺苷、毛蕊异黄酮、芒柄花苷对照品以及10批红芪供试品溶液,按照1.5节的色谱条件进行测定,结果见图 1和图 2。10批红芪乙醇提取部位的HPLC-DAD指纹图谱中,共确定了9个共有峰,通过与对照品的保留时间及紫外吸收比较,2号峰、7号峰及9号峰分别鉴定为腺苷、毛蕊异黄酮和芒柄花苷。

图 1 10批红芪乙醇提取部位的HPLC-DAD指纹图谱 Fig. 1 HPLC-DAD fingerprints of the ethanol extracts of Radix Hedysari from ten different sources Peak identifications: 2. adenosine; 7. calycosin; 9. ononin.

图 2 对照品的HPLC图谱(260 nm) Fig. 2 HPLC chromatogram of controls (260 nm)
2.3.2 方法学考察

精密吸取芒柄花苷对照品溶液20 μ L,按上述色谱条件连续进样5次,以测试仪器精密度;按照1.5.3节方法制备供试品溶液(9号红芪药材),精密吸取20 μ L,分别在0、3、6、9、10、12 h进样,以考察供试品溶液的稳定性;取同一批红芪药材(9号红芪药材),按照1.5.3节方法平行制备6份供试品溶液,精密吸取20 μ L,进样,以考察方法的重复性。结果各考察项下,指纹图谱中各色谱峰的相对保留时间及相对峰面积的RSD均＜3% ,说明仪器精密度良好,供试品溶液12 h内稳定,方法重复性好;将腺苷、毛蕊异黄酮及芒柄花苷对照品溶液定量加入已测定含量的供试品溶液(9号红芪药材)中,重复测定6次,得腺苷、毛蕊异黄酮及腺苷的平均回收率分别为96.88% 、97.76% 、97.93% ,RSD分别为1.95% 、2.52% 、2.01% 。

2.4 谱效相关性分析
2.4.1 灰色关联度相关分析[19]

将峰面积数据与ALT药效学数据进行关联。通过对原始数据标准化转化后,计算关联度,得各峰对药效的贡献程度排名为:7＞2＞5＞3＞1＞6＞4＞9＞8。几乎共有峰所代表的化学成分与药效的关联度均＞0.8(除8号峰外),可以看出红芪抗肝纤维化药效是多种成分共同作用的结果(见表 4)。

表 4 10批红芪药材乙醇提取部位的共有峰峰面积、保留时间、ALT药效值(R)及峰面积与R的灰色关联度 Table 4 Peak areas of common peaks,retention times and ALT medicinal values (R) of the ethanol extracts of Radix Hedysari from 10 samples and grey relational grades between peak areas and R
2.4.2 偏最小二乘法相关分析[20]

利用SIMCA-P 11.5软件,经过多次提取主成分,多次迭代,拟合出峰面积与药效数据之间的数理方程:y=-0.253 4P1+0.341 4P2-0.422 4P3-0.575 6P4+0.219 4P5-0.473 3P6+0.350 5P7-0.341 4P8-0.093 37P9(P1～P9为共有峰面积,y为红芪乙醇部位抗肝纤维化药效),各峰所代表的化学成分对抗肝纤维化药效贡献大小顺序为:7＞2＞5＞9＞1＞3＞6＞8＞4,其中7、2、5与药效呈正相关,而9、1、3、6、4、8与药效呈负相关。

2.5 讨论
2.5.1 统计方法

本文采用灰色关联度和偏最小二乘的统计方法研究谱效关系。灰色关联度主要分析两种因素在发展过程中的关联度大小,若发展趋势一致,则关联度大,反之关联度小。主要步骤包括:原始数据转换、求绝对差序列、确定关联系数,进而确定关联度,排列出关联序[21]。但灰色关联度法只是单独考察了各成分的重要性,并不能反应各成分对药效的综合作用,故而本文又采用偏最小二乘的方法,通过拟合药效与HPLC色谱峰之间的数理方程,以具体的数学表达式综合反映了各成分对药效的重要性。

2.5.2 药效学实验

CCl4已被广泛地应用于诱导动物肝纤维化模型,在肝滑面内质网受微粒体细胞色素P450激活后,分解成为活泼的三氯甲基自由基,进而与细胞膜上的磷脂部分结合,产生脂质过氧化反应,引起细胞器甚至细胞膜的变性和坏死,最终导致肝细胞坏死[22]。CCl4亦可使钙离子水平增加,激活肝细胞膜上的磷酸化酶,从而引起膜的脂质过氧化,导致肝细胞膜损伤[23]。CCl4肝纤维化模型是一种经典的实验研究模型,它能准确反映肝细胞功能、代谢及形态学变化,重复性较好,而局限性在于实验动物的个体差异,对于肝纤维化的反应不具有绝对的一致性,同时给药途径、剂量、周期等对实验结果也有影响[24]。本实验以四氯化碳-花生油(4 ∶ 6,v/v)溶液造成小鼠肝纤维化模型,选取有表征性的血清指标及肝重指数全面评价药效,筛选有效给药提取部位时,测定出乙醇提取部位的6个指标与模型组均有极显著性差异(p＜0.01,p＜0.001);以此为据开展后续实验,测定10批不同产地的红芪乙醇提取部位的6个指标,实验结果亦良好,大部分指标显著性差异达到p＜0.01,其药效在大批量样本的验证下得到充分肯定,这才值得我们进一步探究其发挥药效的物质基础。

柳姜冰等[10]研究了红芪多糖对D-氨基半乳糖所致的实验性肝损伤的保护作用,本研究则表明水提醇沉的红芪多糖和乙醇提取部位对四氯化碳所致的肝纤维化均有良好的保护作用,扩大了对红芪抗肝损伤及肝纤维化的有效部位研究。

2.5.3 HPLC色谱条件优化

对色谱柱、流动相组成和配比、柱温、检测波长等一系列色谱条件进行了优化。流动相曾使用甲醇-水的组合,但得到的色谱峰容量少且分离度不好,故而改用洗脱能力较强的乙腈与水的组合,检测波长选择260 nm,结果峰容量大且分离度好。

3 结论

灰色关联度法和偏最小二乘法两种统计结果表明,7号峰所表示的毛蕊异黄酮和2号峰所表示的腺苷对药效的贡献最大,总体来看,各成分与药效的关联都较大(＞0.8),可见红芪抗肝纤维化药效是各成分共同作用的结果。毛蕊异黄酮及腺苷在指纹图谱中看来含量较低,但却是发挥主要作用的药效物质,而9号峰所表示的芒柄花苷虽然含量较高,但却与药效关联程度不高,甚至在偏最小二乘中与药效呈负相关,由此可见中药的复杂性。所以通过“谱效相关”的研究,才能有效辨别红芪中真正发挥药效作用的化学成分。本文鉴定了共有峰中的3个成分,其余成分有待进一步鉴定。后续研究中本实验室将分离纯化红芪中的活性成分,进行体内代谢研究及体外细胞活性研究,从分子水平验证其与抗肝纤维化疗效的相关性机理,更加全面地阐述红芪抗肝纤维化的药效物质基础。

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