色谱  2015, Vol. 33 Issue (4): 403-407   PDF (1722 KB)    
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马新宇
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曹玉华
曹光群
聚(苯乙烯-co-甲基丙烯酸)自组装胶束假固定相电动色谱的特性
马新宇1, 倪鑫炯1, 卢婕1, 邢晓平2, 曹玉华1 , 曹光群1     
1. 江南大学化学与材料工程学院, 江苏 无锡 214122;
2. 盐城工学院化学与生物工程学院, 江苏 盐城 224051
收稿日期：2014-12-31
基金项目：国家自然科学基金项目(21174056,21405133).
通讯作者：曹玉华, E-mail: yuhuacao64@gmail.com, 曹光群, E-mail: gqcao59@126.com.
摘要：研究了两亲性无规共聚物聚(苯乙烯-co-甲基丙烯酸)(P(St-co-MAA))(单体摩尔比分别为6:4和7:3)自组装胶束的物理化学性质,及其作为假固定相(PSP)的胶束电动色谱性能。测定了聚合物胶束的临界胶束浓度(CMC),对胶束内核微环境的极性、表面电荷密度和流体力学直径等微结构参数进行了表征,对时间窗口、亚甲基选择性等电动色谱参数进行了测定,并与聚(甲基丙烯酸甲酯-co-甲基丙烯酸)(P(MMA-co-MAA))胶束、十二烷基硫酸钠(SDS)胶束体系进行了比较;利用线性溶剂化能关系(LSER)研究了聚合物PSP的选择性差异。结果表明:P(St-co-MAA)体系具有最小的CMC、最宽的时间窗口和最好的亚甲基选择性;LSER表明,疏水作用是决定聚合物PSP选择性的最主要因素,氢键酸度其次,特别是P(St-co-MAA)(单体摩尔比7:3)体系具有最高的作用参数,显示了该PSP具有较高的分离选择性。
关键词： 胶束电动色谱     两亲性无规共聚物     假固定相     线性溶剂化能关系    
Electrokinetic chromatographic properties of amphiphilic copolymer poly (styrene-co-methacrylic acid) self-assembled micelle pseudostationary phase
MA Xinyu1, NI Xinjiong1, LU Jie1, XING Xiaoping2, CAO Yuhua1 , CAO Guangqun1     
1. School of Chemical and Material Engineering, Jiangnan University, Wuxi 214122, China;
2. Chemical and Biological Engineering College, Yancheng Institute of Technology, Yancheng 224051, China
Received: 2014-12-31
Abstract: The amphiphilic copolymer poly (styrene-co-methacrylic acid) (P(St-co-MAA)) with molar ratios of 6:4 and 7:3 self-assembled to form micelles. The polymeric micelles were used as pseudostationary phase (PSP) in micellar electrokinetic chromatography (MEKC). Their physicochemical properties and MEKC performance were investigated as well in the present work. The critical micelle concentration (CMC), polarity, surface charge density and hydrodynamic diameter were used to characterize the solution physicochemical properties, while the methylene group selectivity was evaluated with n-alkylphenone homologous series. The time window and linear solvation energy relationship (LSER) analysis were used to characterize the MEKC retention behavior and the selectivity. All of these were compared with poly (methyl methacrylate-co-methacrylic acid) (P(MMA-co-MAA)) with the molar ratio of 7:3 and sodium dodecyl sulfate (SDS) micellar systems. The results showed that P(St-co-MAA) system had the minimum CMC, the widest time window and the best methylene group selectivity. LSER analysis results showed that the hydrophobic effect was the most important interaction between solutes and PSPs, and the hydrogen-bonding acidity was the second significant factor on selectivity and MEKC retention behavior. P(St-co-MAA) system, especially with the molar ratio of 7:3, had the highest effective parameter in LSER and showed a high separation selectivity of PSP.
Key words: micellar electrokinetic chromatography (MEKC)     amphiphilic random copolymer     pseudostationary phase (PSP)     linear solvation energy relationships (LSER)    

胶束电动色谱法(MEKC,micellar electrokinetic chromatography)最初由Terabe等[1]在毛细管区带电泳基础上引入十二烷基硫酸钠(SDS)胶束作为假固定相(PSP)而建立。MEKC对中性及带电物质均具有良好的分离能力。然而,离子型表面活性剂由于其临界胶束浓度(CMC)大、胶束结构易受外部环境影响、对强疏水性物质增溶量低等一系列问题使其作为PSP在MEKC中存在一定的局限性。

两亲性无规共聚物因疏水单体的疏水作用和亲水单体的静电斥力作用能自组装形成胶束[2]。Palmer等[3]将聚(2-丙烯酰胺基-2-甲基丙烷磺酸钠-co-二氢胆甾醇丙烯酸酯)作为PSP用于MEKC,在138 s内分离了12种多环芳烃。文献[4, 5, 6, 7, 8]也报道过其他聚合物PSP能提供良好的分离性能,但是所用单体结构比较复杂,市场上很难买到。本课题组[9, 10]合成了两亲性无规共聚物聚(甲基丙烯酸甲酯-co-甲基丙烯酸)(P(MMA-co-MAA)),采用溶解法一步自组装形成胶束,将其作为PSP成功分离了8种糖皮质类激素。

虽然无规共聚物作为PSP拥有良好的分离性能,但是研究聚合物PSP的理化特性和微观结构的报道较少[11, 12, 13, 14, 15],线性溶剂化能关系(LSER,Linear solvation energy relationships)[16, 17]作为一种方法常被用来研究固定相的保留机制[18, 19, 20, 21]。本课题组[22]对P(MMA-co-MAA)自组装胶束作为PSP的理化性质和电动色谱特性进行了研究。两亲性聚合物的单体种类或比例均能影响聚合物胶束的微观结构和电动色谱特性,能为改变PSP的选择性提供路径。本文改变了无规聚合物的疏水单体,引入了疏水性更强的苯乙烯(St)代替甲基丙烯酸甲酯(MMA),对比研究聚(苯乙烯-co-甲基丙烯酸)(P(St-co-MAA))胶束(单体摩尔比分别为6 ∶ 4和7 ∶ 3)与P(MMA-co-MAA)胶束(单体摩尔比7 ∶ 3)的理化性质和电动色谱特征,以SDS胶束作为参比,测定胶束的CMC、内核极性、表面电荷密度、胶束粒径以及作为PSP的时间窗口和亚甲基选择性;并利用LSER研究了PSP的保留机制。

1 实验部分
1.1 仪器与试剂

TH-3000型高效毛细管电泳仪(中国保定天惠分离科学研究所),熔融石英毛细管(河北永年光敏纤维厂,65 cm×50 μ m,有效长度50 cm); Cary Eclipse荧光分光光度计(美国瓦里安有限公司); Zeta PALS电位及纳米粒度分析仪(美国布鲁克海文公司); JEM-2100透射电子显微镜(日本); Milli-Q Reference超纯水机(美国Millipore公司)。

苯乙酮、苯丙酮、苯丁酮、苯戊酮、苯己酮、苯癸酮、芘(J＆K公司)。苯、甲苯、联苯、苄醇、4-硝基苯胺、萘、二苯甲酮、苯胺、乙酰苯胺、苯甲酸甲酯、硝基苯、苯甲醛、4-甲基苯胺、4-氯硝基苯、苯乙醇、4-硝基甲苯、3-硝基甲苯、2-硝基甲苯、十二烷基硫酸钠、硼砂、氢氧化钠(分析纯,上海国药集团化学试剂有限公司); P(St-co-MAA)(St与MAA单体摩尔比分别为7 ∶ 3和6 ∶ 4,单体比例经核磁共振氢谱(1H-NMR)测定后计算得到,简称PSM7 ∶ 3和PSM6 ∶ 4)和P(MMA-co-MAA)(MMA与MAA单体摩尔比为7 ∶ 3,简称PMM7 ∶ 3)均为实验室自制[9],经凝胶渗透色谱(GPC)测定,数均相对分子质量(Mn)分别为 64 900、69 100、54 300,多分散度分别为1.26、1.19、1.17。

1.2 溶液的制备

称取3种无规共聚物适量,分别加入0.1 mol/L NaOH中,缓慢搅拌至溶液均匀透明,加入固体硼酸调节pH,配制成7.5 g/L 的运行缓冲溶液(pH 9.2);称取适量SDS加入0.1 mol/L 的硼砂缓冲液中,配制成7.5 g/L 的运行缓冲溶液(pH 9.2);称取适量苯、甲苯、联苯、苄醇、萘、4-硝基苯胺、二苯甲酮、苯胺、乙酰苯胺、苯甲酸甲酯、硝基苯、苯甲醛、4-甲基苯胺、4-氯硝基苯、苯乙醇、4-硝基甲苯、3-硝基甲苯、2-硝基甲苯、苯乙酮、苯丙酮、苯丁酮、苯戊酮、苯己酮、苯癸酮,分别加甲醇溶解,配制成24种5 g/L 的标准储备液,于4 ℃冰箱内避光保存,使用时用甲醇稀释成不同浓度的标准溶液;称取适量PMM7 ∶ 3、PSM7 ∶ 3、PSM6 ∶ 4、SDS,分别用芘饱和的0.1 mol/L NaOH溶液溶解,配制成一系列不同浓度的溶液,浓度范围均为 0.000 1～10 g/L,加入硼酸调节pH至9.2,室温下振荡过夜,静置24 h后测定芘荧光光谱。

1.3 实验方法

MEKC运行条件:运行电压25 kV;柱温25 ℃;电动进样3 s/20 kV;紫外检测波长254 nm。毛细管在每天使用前及两次运行之间分别用超纯水、0.1 mol/L NaOH、运行缓冲溶液各冲洗5 min。所有溶液在使用前均用0.45 μ m微孔滤膜过滤后使用。

芘荧光探针法测定CMC及胶束内核极性:荧光扫描的激发波长为335 nm,激发狭缝和发射狭缝均
设置为3.0 nm,扫描345～450 nm范围内的芘发射光谱,扫描速度为500 nm/min,样品池厚1 cm。芘的稳态荧光光谱有5个峰,其第一峰(373 nm)和第三峰(384 nm)的峰强之比(I1/I3)反映了芘所在微环境的极性,I1/I3越大,微环境极性越小。测试一系列不同浓度(c)的样品,绘制I1/I3与lg c曲线,取其一阶导函数极大值处确定I1/I3的S形曲线的拐点,其相应的聚合物浓度为CMC。

Zeta电位测定方法:在25 ℃下,将5 mL待测的胶束溶液注入进样口,平行测定5次,取平均值。

透射电子显微镜(TEM)表征:3种无规共聚物溶液分别滴在覆有碳膜的电镜铜网表面,室温下自然干燥后表征。

2 结果与讨论
2.1 物理化学性质和胶束微结构

CMC表明了两亲性聚合物分子在溶剂中缔合形成胶束的最低浓度;胶束内核的微极性则影响溶质在PSP中的保留。PSP的内核极性过小,疏水性强溶质容易被保留,其迁移时间接近PSP的迁移时间,造成分离困难、耗时;PSP的内核极性过大,会使疏水性溶质的保留变弱,分离选择性差。因此,PSP的CMC和微极性对分离具有重要意义。表 1中,无规共聚物胶束的CMC均比SDS的CMC值[23]小1～2个数量级;SDS、PSM7 ∶ 3、PSM6 ∶ 4、PMM7 ∶ 3的内核极性依次增大。原因是SDS的疏水基团是烷基链;PSM7 ∶ 3和PSM6 ∶ 4中的疏水单体是苯乙烯,且前者的苯乙烯的单体摩尔比大于后者;PMM7 ∶ 3中的疏水单体是甲基丙烯酸甲酯。说明内核极性随着疏水基团极性的增大而增大,随疏水单体比例的增大而减小;随着疏水单体的极性减小或疏水单元单体比的增加,疏水作用增强,易于胶束化,导致无规共聚物胶束的CMC减小。

表 1 PSP的物理化学性质以及电动色谱特性 Table 1 Physicochemical and MEKC properties of PSPs

PSP的表面电荷密度和流体动力学直径决定了电泳迁移率,影响其时间窗口、峰容量和分离度[24]。负表面电荷密度大、胶束直径小会使与电渗流反方向的PSP电泳迁移率变大,从而扩大时间窗口,显著提高系统的峰容量和分离度。表面电荷密度可以由Zeta电位间接测定,从表 1看出SDS的负Zeta电位最大,PMM7 ∶ 3、PSM6 ∶ 4、PSM7 ∶ 3的负Zeta电位依次减小。

图 1为3种PSP胶束的TEM图,可以看出3 种无规共聚物均自组装成球形胶束,PSM6 ∶ 4由直径为15 nm左右的较小胶束汇聚成直径为50～80 nm的大胶束(见图 1a); PSM7 ∶ 3较小胶束的直径在9 nm左右,汇聚成的大胶束直径为30～50 nm(见图 1b); PMM7 ∶ 3较小胶束的直径集中在20 nm左右,汇聚成的大胶束直径为100～200 nm(见图 1c)。PSM7 ∶ 3的胶束直径最小,因为其内核极性最小、外壳静电斥力大,因此聚合物胶束聚集紧密;其次是PSM6 ∶ 4; PMMA7 ∶ 3的胶束直径最大。胶束的直径与疏水单体的疏水作用和亲水单体的静电斥力相关。疏水作用使内核聚集紧密,这与疏水单体的极性以及聚合物中单体摩尔比有直接关系。

图 1 (a)PSM6 ∶ 4、(b)PSM7 ∶ 3和(c)PMM7 ∶ 3自组装胶束的TEM图 Fig. 1 TEM images of polymeric micelles self-assembled by (a) PMM7 ∶ 3,(b) PSM7 ∶ 3 and (c) PSM6 ∶ 4
2.2 电动色谱性能

时间窗口的定义是tmc/teo,其中tmc和teo分别是PSP与电渗流的迁移时间,与电渗迁移率 μ eo(使用甲醇作为标记物来确定)和PSP的电泳迁移率 μ ep(使用苯癸酮作为标记物确定)有关。中性溶质的洗脱时间介于teo与tmc之间,因此电动色谱受到时间窗口的限制。表 1中,PSM7 ∶ 3的时间窗口最宽,其次是PSM6 ∶ 4,PSM胶束系统的分析窗口均大于SDS胶束体系,PMM7 ∶ 3的时间窗口最窄。无规共聚物PSP的疏水单体极性小,疏水单体比例高,对扩宽时间窗口有利。

亚甲基选择性( α CH2)用于测量PSP的选择性,α CH2是通过计算由一组同系正构烷基苯酮的log k(k是溶质的保留因子)与其烷基链长度(n)所做回归线的斜率而得到[17]。 α CH2值大表示PSP对疏水性物质的选择性好。从表 1看出,PSM7 ∶ 3的 α CH2最大,依次是SDS和PSM6 ∶ 4,PMM7 ∶ 3最小。虽然PSM7 ∶ 3的内核极性大于SDS,但其 α CH2大于SDS,说明PSM7 ∶ 3作为PSP对非极性物质的选择性要大于SDS胶束。

2.3 LSER分析


在MEKC中,溶质的分离主要依靠其在与水相和PSP之间[25, 26, 27]的分配,LSER定量描述了PSP的疏水性、PSP与溶质之间的氢键作用和偶极作用等方面的信息,LSER[16, 17]可表达为:

log k=mVx+rR2+s π 2H+a∑ α 2H+b∑ β 2H+c

其中自变量是溶质分子的描述符;Vx是McGowan特征常数(cm3/mol); R2是剩余摩尔折光率(cm3/10); π 2H是溶质的偶极矩/极化率;∑ α 2H是溶质的有效氢键酸度;∑β2H是溶质的有效氢键碱度。系统常数m、r、s、a、b、c可通过对一系列已知描述符溶质的log k作多元线性回归分析而确定。表 2列举了23种化合物用来构建LSER模型,
表 3中23种化合物的互相关矩阵(r)小于0.8。在浓度、pH、离子强度均相同的条件下,4种PSP的回归统计量见表 4。c项与相比直接相关,即当相比减小时,常数变得更小(更负),这对所有溶质的影响程度相同,因此该项对选择性无影响。

表 2 测试溶质的各项描述符 Table 2 Descriptors of the test solutes

表 3 测试溶质的相关性矩阵 Table 3 Descriptors of the cross-correlation matrix of the test solutes

表 4 4种PSP的LSER模型参数 Table 4 LSER models for PSPs

mVx项表示由于疏水作用引起的自由能变化,m值表示水相与PSP相之间内聚力的差异。从表 4可见m值均为正,且是5个系数中最大的,表明疏水作用是溶质与PSP之间最主要的作用;PSM7 ∶ 3的m值最大,其次是SDS和PSM6 ∶ 4,PMM7 ∶ 3的m值最小。这与 α CH2的规律是一致的,说明聚合物PSP的极性越小,其与溶质的疏水作用越强,m值越大。

b值表示PSP与水相之间氢键酸度的差异。由表 4可知b均为负值,说明PSP的氢键酸度比水相弱。b值的绝对值仅次于m值,是影响PSP选择性的第二大因素。PSM7 ∶ 3的绝对值最大,PSM6 ∶ 4,SDS和PMM7 ∶ 3依次减小。a值表示PSP与水相间氢键碱度的差异,PSM7 ∶ 3、PSM6 ∶ 4和SDS的a值均为负值,说明3种PSP接受质子氢的能力均小于水;而PMM7 ∶ 3的a值为正,说明PMM7 ∶ 3接受质子氢的能力大于水。PMM7 ∶ 3、PSM6 ∶ 4、SDS、PMM7 ∶ 3的a值的绝对值依次减小。综上所述,氢键作用对PSM7 ∶ 3的影响最大,其次分别为PSM6 ∶ 4、SDS和PMM7 ∶ 3。

r值表示溶质的 π 和n电子作用在水相与PSP之间的差异。从表 4可见r值均为正,PSM7 ∶ 3的r值最大,PSM6 ∶ 4、PMM7 ∶ 3和SDS的r值依次减小,说明溶质的 π 和n电子与PSP和水相之间的作用差异依次减小,这与溶质的 π 和n电子与硫-氧键、碳-氧双键、苯环之间相互作用依次增强有关。s值表示溶质在水相和PSP之间发生偶极-偶极和偶极-诱导偶极作用的差异,表 4中s均为负值,说明溶质更易与水相发生偶极-偶极和偶极-诱导偶极作用。s值的绝对值也是PSM7 ∶ 3最大,PSM6 ∶ 4、SDS和PMM7 ∶ 3依次减小,说明在pH 9.2的碱性条件下羰基、酯基不易与溶质发生偶极-偶极和偶极-诱导偶极作用。

3 结论

P(St-co-MAA)体系与SDS胶束体系和P(MMA-co-MAA)体系相比,具有极性更小的疏水单元、最小的临界胶束浓度、最大的时间窗口、最大的亚甲基选择性。LSER研究表明,疏水作用和氢键酸度作用是影响PSP选择性的最主要因素,最大的作用参数表明P(St-co-MAA)体系的PSP具有较大的选择性,且疏水单元单体摩尔比增大更有利。

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