色谱  2015, Vol. 33 Issue (5): 530-534   PDF (781 KB)    
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杜晖
周娜
李静静
范菲
细胞膜色谱法研究5-羟色胺受体与藁本内酯的亲和作用
杜晖 , 周娜, 李静静, 范菲    
西安市食品药品检验所, 陕西 西安 710054
收稿日期：2015-01-04
基金项目：陕西省中医药管理局科研课题(13-ZY005).
通讯作者：杜晖,E-mail:duhui0504@126.com.
摘要：建立了大鼠纹状体细胞膜色谱前沿分析法,研究5-羟色胺(5-HT)受体5-HT1D与藁本内酯的亲和作用。通过大鼠纹状体组织制备得到色谱固定相,利用酶联免疫吸附剂测定法(ELISA)分别测定硅胶吸附前后细胞膜悬液中5-HT的量,求得细胞膜固定相上5-HT受体含量为每克硅胶(40.5±2.3) pg。利用细胞膜色谱与液相色谱的离线联用,特异性地识别混合对照品中的舒马普坦和藁本内酯;以不同浓度(24.2~242 nmol/L)的5-HT1D受体激动剂舒马普坦为模型药物,连续通过细胞膜色谱柱,记录舒马普坦的突破曲线,测得舒马普坦与受体作用的平衡解离常数(KD)为389 nmol/L;并将舒马普坦通过不同浓度(37.0~370 nmol/L)的藁本内酯饱和后的细胞膜色谱柱,记录色谱柱饱和前后舒马普坦突破曲线的变化,测得藁本内酯与受体作用的KD值为4.21 μmol/L。该方法快速、有效,适用于求解存在竞争结合时药物与受体作用的平衡解离常数。
关键词： 细胞膜色谱     前沿分析     舒马普坦     藁本内酯     5-羟色胺受体    
A cell membrane chromatography method for investigation of 5-hydroxytryptamine receptor-ligustilide interaction
DU Hui , ZHOU Na, LI Jingjing, FAN Fei    
Xi'an Institute for Food and Drug Control, Xi'an 710054, China
Received: 2015-01-04
Abstract: A rat striatum cell membrane chromatography (CMC) frontal analysis method was developed for the determination of the equilibrium dissociation constants (KD) for 5-hydroxytryptamine (5-HT) receptor 5-HT1D-ligustilide interactions. Rat striatum was used for preparation of the cell membrane stationary phase (CMSP). An enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) was applied to determine the 5-HT level of CMSP before and after the adsorption of cell membrane, and the value was (40.5±2.3) pg per gram of silica. The CMC-offline-HPLC system was applied to specifically recognize the mixed standard solution of sumatriptan and ligustilide. Sumatriptan, a 5-HT1D agonist of 24.2 to 242 nmol/L, was pumped through a CMC column continuously, and the breakthrough curves were recorded. For further competitive studies, the mobile phase that contained ligustilide (37.0-370 nmol/L) was pumped through the column to saturate the binding sites. Afterwards, sumatriptan was propelled towards the column. The breakthrough curves were recorded and compared with those obtained from the column without saturation. KD values obtained using frontal analysis were 389 nmol/L and 4.21 μmol/L for sumatriptan and ligustilide, respectively. The competitive binding study indicated that the CMC method could be a quick and efficient way for determining the KD values in drug-receptor interactions.
Key words: cell membrane chromatography (CMC)     frontal analysis     sumatriptan     ligustilide     5-hydroxytryptamine (5-HT) receptor    

偏头痛是临床上的常见疾病,其发病率高,病程长,易反复[1]。川芎是中药治疗偏头痛的基本用药,近年来有学者对川芎提取物治疗偏头痛的作用机理进行了初步的探索,发现给药后大鼠脑组织和血浆中5-HT(5-hydroxytryptamine)和降钙素基因相关肽(calcitonin gene related peptide,CGRP)的含量分别升高和降低[2,3]。藁本内酯是川芎中的主要活性成分,对心脑血管及循环系统等均有较强的药理作用,但因其稳定性不佳,作用机理的研究尚不够深入和细致[4,5]。因此,研究5-HT受体的重要亚型5-HT1D与藁本内酯的亲和作用,在了解药物作用机制和开发高效治疗偏头痛药物方面显得尤为重要。生物亲和色谱已成为药物筛选和有效成分分离富集的有效手段[6,7],但通过“温和、可控”的方式获得有效的药物-受体作用参数仍难以实现。细胞膜色谱法使用含有特定受体的、并具有膜制剂性质和膜受体立体结构的细胞膜固定相,结合高效液相色谱法来研究药物与固定相上膜受体的相互作用[8,9,10,11,12]。本文将选择性5-HT1D受体激动剂舒马普坦作为模型药物,将其通过不同浓度藁本内酯饱和后的细胞膜色谱柱,记录色谱柱饱和前后舒马普坦突破曲线的变化,获得藁本内酯与受体作用的平衡解离常数。

1 实验部分
1.1 仪器与试药

安捷伦 1260 高效液相色谱仪;HC-3018R型低温冷冻高速离心机(合肥科大创新股份有限公司); Elx800酶标仪(美国BIO-TEK公司); RPL-ZD10型装柱机(大连日普利科技仪器有限公司);柱套及配套柱芯(10 mm×2.0 mm)。

琥珀酸舒马普坦对照品(批号 100603-200401)购自中国食品药品检定研究院;藁本内酯对照品为实验室自制,经HPLC测定纯度为98.0% ; BCA蛋白定量试剂盒、大鼠5-HT和CGRP试剂盒来自武汉华美生物工程有限公司;大孔硅胶(ZEX-Ⅱ,5 μ m,10 nm)购自青岛美高化工有限公司;实验用水来自Milli-Q超纯水系统(美国密理博公司)。健康Sprague-Dawley(SD)大鼠(5～7周龄,约250 g)购自西安交通大学实验动物中心。

1.2 大鼠纹状体和大脑组织细胞膜固定相的制备

健康SD大鼠断颈处死后,迅速取出大脑,剥离纹状体,将大脑和纹状体组织分别置于预冷的生理盐水中，洗尽其他残留组织，在预冷的生理盐水中剪碎后置于冰浴内的玻璃匀浆管中匀至糜状。按照文献[13]方法制备细胞膜悬液,并制备经细胞膜悬液吸附和未经细胞膜悬液吸附的硅胶色谱柱。

1.3 实验方法
1.3.1 色谱条件

细胞膜色谱条件:流动相为5 mmol/L 磷酸盐缓冲液(pH 7.4);二极管阵列检测器;进样量为5 μ L;柱温为37 ℃;流速为0.2 mL/min。

液相色谱条件:Dikma C18柱(150 mm×4.6 mm,5 μ m);流动相为甲醇-25 mmol/L 磷酸二氢钾-三乙胺(65 ∶ 35 ∶ 1,磷酸调节pH至4.0);检测波长为280 nm;进样量为5 μ L;柱温为30 ℃;流速为1.0 mL/min。

1.3.2 大鼠纹状体细胞膜色谱的建立

细胞膜色谱柱连入色谱仪平衡至基线稳定后,将模型药物5-HT1D受体激动剂舒马普坦和藁本内酯的混合对照品甲醇溶液(0.1 mmol/L)注入色谱仪,记录药物的细胞膜色谱图;然后将色谱的洗脱组分收集浓缩,甲醇定容,进行高效液相色谱分析。

1.3.3 药物与5-HT1D受体亲和作用研究

实验中,模型药物5-HT1D受体激动剂舒马普坦作为置换剂溶于流动相中,并按浓度由低到高(2.42×10-8、4.84×10-8、1.21×10-7、1.94×10-7和2.42×10-7 mol/L)连续通过细胞膜色谱柱,记录舒马普坦的突破曲线。接下来,将样品藁本内酯作为置换剂溶于流动相中,并按浓度由低到高(3.70×10-8、7.40×10-8、1.85×10-7、2.96×10-7和3.70×10-7 mol/L)连续通过细胞膜色谱柱,而后将舒马普坦(1.0 μ mol/L)分别通过上述饱和后的细胞膜色谱柱,记录藁本内酯饱和色谱柱前后舒马普坦突破曲线的变化,从而计算模型药物、置换剂与受体作用的平衡解离常数,即所谓的前沿置换分析[14,15]:

式(1)可转化为

式中:KD为置换剂的平衡解离常数(mol/L); KM为模型药物的平衡解离常数(mol/L); V为前沿分析时配体的突破体积(最高响应50%处)(L); V0为色谱柱达到饱和时配体的突破体积(L); [D]m为置换剂的浓度(mol/L); Rs为固定相上受体的物质的量(mol)。

当模型药物和置换剂均为舒马普坦时,式(2)可简化为:

以1/(V-V0)对舒马普坦的浓度[D]m作图,回归曲线的截距和斜率之比即为舒马普坦的KM值。将其代入式(2),即可算得藁本内酯与5-HT1D受体作用的平衡解离常数。

1.3.4 硝酸甘油造模

复制硝酸甘油致偏头痛模型,雄性SD大鼠40只,随机分成A、B、C、D共4组,每组10只。A组为正常对照组,B组为模型组,按照20 mL/kg灌胃给以蒸馏水;C组为阳性对照组,按照10 mg/kg 剂量灌胃给以阳性药物舒马普坦;D组按照10 mg/kg 剂量灌胃给以藁本内酯。每天早上10点给药一次,连续给药7天。末次给药后30 min,除A组大鼠外,其余各组按照10 mg/kg 剂量在大鼠右肩皮下注射硝酸甘油,复制硝酸甘油致偏头痛模型。造模4 h后用乙醚将大鼠麻醉,断颈处死后剥离大脑组织,准确称重并记录,加入2 mL磷酸缓冲液匀浆,静置20 min后涡旋,于4 ℃下 5 000 r/min 离心10 min,取上清液放入-20 ℃冰箱预冻一夜后转入-80 ℃冰箱中。

2 结果与讨论
2.1 细胞膜色谱固定相的生物学特性

为了更好地表征细胞膜固定相,实验中我们采用BCA(bicinchoninic acid)和ELISA法(enzyme-linked immunosorbent assay)分别测定了细胞膜悬液经硅胶吸附前后总蛋白和5-HT蛋白含量的变化,它们之间的差值即为细胞膜固定相上两者的含量。结果表明在总蛋白含量相当的情况下,纹状体-固定相中5-HT的含量为每克硅胶(40.5±2.3) pg,较大脑组织-固定相提高了近5倍,由此可见实验成功制备了包含5-HT受体的纹状体细胞膜色谱固定相。

固定化受体的来源可以是组织、野生细胞或转染细胞系。组织或野生细胞系可以为目标受体提供一个天然的环境,对于在一根色谱柱中研究多种受体并描述配体在受体间的竞争结合具备先天优势[16]。

2.2 大鼠纹状体细胞膜色谱有效性的验证

利用舒马普坦和藁本内酯的混合对照品溶液验证系统的有效性。如图1a所示,样品在2.1 min和11.9 min处有两个洗脱峰(R2、R1),证实了细胞膜上受体与两者有强度不同的亲和作用,且选择性良好;将色谱的洗脱组分R1和R2分别收集浓缩,甲醇定容,进行高效液相色谱分析,再与混合对照品色谱图比对(见图1b和c),R1和R2分别为藁本内酯和舒马普坦,两者在液相色谱中的保留时间分别为11.2和4.3 min。

图1 (a)舒马普坦和藁本内酯混合对照品溶液在细胞膜色谱模型中的洗脱组分(R1和R2)、(b)洗脱组分R1和R2分别在HPLC分析时的色谱图和(c)舒马普坦和藁本内酯混合对照品溶液在HPLC分析时的色谱图 Fig.1 (a) CMC chromatogram of mixed standard solution of sumatriptan and ligustilide including R1 and R2 fractions,(b) HPLC chromatograms of R1 and R2 fractions and (c) HPLC chromatogram of mixed standard solution of sumatriptan and ligustilide Peaks: 1. sumatriptan; 2. ligustilide.

同时我们验证了未经细胞膜悬液吸附的硅胶色谱柱,样品在1.9和2.8 min处也有两个洗脱峰,但两峰无法完全分离。空白硅胶与经细胞膜悬液处理的硅胶吸附原理不同,后者表面已被细胞膜覆盖,与小分子的作用是一种特异性的亲和,这种亲和作用随着固定相表面受体的失活而逐渐减弱,表现出来的就是细胞膜色谱中小分子的洗脱时间逐渐缩短。

2.3 亲和强度分析

舒马普坦的前沿色谱图如图2a所示,可以看到突破曲线的拐点时间随着流动相中舒马普坦浓度的增加而提前,其程度与细胞膜固定相表面的受体数目、流动相中配体浓度和配体-受体亲和作用的解离常数的大小有关。根据式(3),以1/(V-V0)对舒马普坦的浓度[D]m进行线性回归,如图2b所示,舒马普坦与5-HT1D受体作用的平衡解离常数为389 nmol/L,相关系数(r)为 0.989 7。

图2 (a)舒马普坦的突破曲线和(b)1/(V-V0)-[D]m回归曲线 Fig.2 (a) CMC breakthrough curves of sumatriptanand (b) a regression curve achieved by plotting 1/(V-V0) versus [D]m Concentrations of sumatriptan: 1. 2.42×10-8 mol/L; 2. 4.84×10-8 mol/L; 3. 1.21×10-7 mol/L; 4. 1.94×10-7 mol/L; 5. 2.42×10-7 mol/L.

实验考察了藁本内酯对舒马普坦的置换能力。如图3所示,当细胞膜色谱柱分别被不同浓度的藁
本内酯饱和后,舒马普坦突破曲线的拐点较饱和前左移。这说明藁本内酯占据了舒马普坦与5-HT1D结合的位点,导致舒马普坦在色谱柱中提前达到吸附饱和。将舒马普坦的平衡解离常数代入式(2),
以1/(V-V0)对藁本内酯的浓度[D]m进行线性回归,求得藁本内酯与5-HT1D受体作用的平衡解离常数为4.21 μ mol/L。

图3 舒马普坦在被不同浓度藁本内酯饱和的色谱柱上的突破曲线 Fig.3 Breakthrough curves of sumatriptan on the column after its saturation with different concentrations of ligustilide Concentrations of ligustilide: 1. 3.70×10-8 mol/L; 2. 1.85×10-7 mol/L; 3. 3.70×10-7 mol/L.
2.4 药物对大鼠大脑组织中5-HT和CGRP含量的影响

如表1所示,与空白组相比,模型组中偏头痛发病的两项指标5-HT和CGRP的含量分别降低和升高,说明硝酸甘油致大鼠偏头痛造模成功。而与模型组相比,舒马普坦和藁本内酯均可显著升高大鼠大脑组织中5-HT的含量,同时降低CGRP水平,且舒马普坦较藁本内酯含量变化更明显。从2.3节得知,舒马普坦与5-HT1D的作用更强,说明在本实验中药物结合强度与药效存在正相关。

表1 舒马普坦和藁本内酯对大鼠大脑组织中5-HT和CGRP含量的影响(n=10,p＜0.05) Table 1 Effect of sumatriptan and ligustilide on the contents of 5-HT and CGRP in the cerebrum of rats (n=10,p＜0.05)
2.5 方法学研究

同时制备5根大鼠纹状体细胞膜色谱柱,分别接入色谱仪中,将舒马普坦对照品溶液(0.1mmol/L)连续进样5次,组内保留时间的RSD值分别为6.23% 、5.10%和6.33% ,组间为7.56% ,证明该方法的重现性基本满足实验要求。

将大鼠纹状体细胞膜色谱柱保存在4 ℃环境中,并在24、48、72 h和1周后进样分析,发现舒马普坦的保留时间分别缩短了3.18% 、4.95% 、8.29%和25.11% ,证明色谱柱在3天内活性基本保持稳定。

轻微改变系统的流动相组成(±0.1 mol/L)、pH值(±0.2)和进样量(±5 μ L),将舒马普坦对照品溶液(0.1mmol/L)分别连续进样5次,RSD值不大于7.50% 。总体来说,我们建立的细胞膜色谱在实验条件范围内稳定性较好。

3 结论

实验所用的组织细胞膜上受体表达多种多样,待测药物与目标受体结合的同时,可能还与膜上其他受体发生亲和作用。本文利用选择性受体激动剂舒马普坦“定位”5-HT1D受体,从而快速准确地求解存在竞争结合时藁本内酯与5-HT1D受体作用的平衡解离常数,方法可靠性较高,为体外高通量筛选有效治疗偏头痛的药物提供理论依据。

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