苯胺类化合物(aniline derivatives,ADs)具有毒性和特殊的颜色、气味,有明显的致癌作用,是我国规定的优先控制污染物[1]。苯胺对血液和神经的毒性作用会使人产生高铁血红蛋白败血症和神经系统症状,严重的甚至引发肝癌和膀胱癌。硝基苯胺化合物可通过呼吸道、消化道而摄入体内,使氧和血红蛋白变为高铁血红蛋白,影响组织细胞供氧而造成内窒息,且被认为对人体有很强的致癌性。联苯胺可经呼吸道、胃肠道、皮肤进入人体,对皮肤可引起接触性皮炎,对黏膜有刺激作用,长期接触可引起出血性膀胱炎,膀胱复发性乳头状瘤和膀胱癌。ADs已被国际癌症研究中心(IARC)确认为致癌物。
国内外研究水质中苯胺类化合物的分析方法主要有分光光度法[2]、荧光光度法[3]、气相色谱法[4]、气相色谱-质谱法[5]、液相色谱法[6,7]、液相色谱-质谱法[8,9]、离子色谱-安培检测法[10]、毛细管电泳法[11]等。其中,分光光度法和荧光光度法只能测定苯胺类化合物的总和,无法针对单一组分进行定性定量分析;采用气相色谱法和气相色谱-质谱法测定水中苯胺类化合物均需对水样进行富集浓缩,前处理方法主要有顶空固相微萃取、液液萃取、吹扫捕集、液液微萃取等;液相色谱法的样品前处理多采用固相萃取、液液萃取、搅拌子吸附萃取等。毛细管电泳法需要衍生,影响因素很多,不易控制和操作;液相色谱-质谱法和离子色谱法由于方法灵敏,多采用直接进样和固相萃取方法处理样品。黄丽芳等[12]采用直接进样结合液相色谱-质谱法测定水样中的5种芳香胺,检出限为1.7～3.2 μ g/L。但采用的是液相色谱-单级质谱而不是串联质谱,定性能力不强,易引起假阳性。杨秋红等[13]采用固相萃取结合液相色谱-串联质谱法(LC-MS/MS)测定水中痕量联苯胺,检出限为1.0×10-3 μ g/L。但仅测定了一种化合物。
目前,采用LC-MS/MS测定苯胺和联苯胺的报道很多,但同时针对14种苯胺类化合物的LC-MS/MS分析方法还未见报道。本文通过优化色谱、质谱条件，建立了直接进样LC-MS/MS分析方法，可同时测定水中14种苯胺类化合物,不需要前处理步骤,简单、快速,而且灵敏度高,抗干扰能力强。
高效液相色谱-串联质谱仪:高效液相色谱仪(日本岛津公司);带ESI源API 4000 QTrap三重四极杆质谱仪(美国AB SCIEX公司); Milli-Q超纯水发生器(美国Millipore公司); Shimadzu Shim-pack FC-ODS色谱柱(75 mm×4.6 mm,3 μ m,日本岛津公司); 0.22 μ m、0.45 μ m聚醚砜(PES)滤膜(德国Membrana公司)、尼龙滤膜和醋酸纤维滤膜(津腾公司)。
甲醇(HPLC级,J&K Scientific Ltd.);甲酸(HPLC级,CNW Technologies);标准物质和标准溶液:邻苯二胺、邻甲氧基苯胺、邻甲苯胺、3-硝基苯胺、3-氯苯胺、2-萘胺、2,4-二甲基苯胺、2,6-二甲基苯胺固体标准物质纯度均大于99%(Dr. Ehrenstorfer GmbH和美国AccuStandard公司);苯胺、联苯胺、对甲苯胺、对硝基苯胺、邻硝基苯胺、对氯苯胺标准溶液均为美国AccuStandard公司生产。固体标准物质需配制成标准储备液,分别准确称取适量的苯胺类标准物质,用甲醇配制成质量浓度为100 mg/L 的标准储备液,-18 ℃以下避光保存。
混合中间标准溶液:吸取适量各标准储备溶液,用甲醇稀释,配制成质量浓度为1 mg/L 的混合中间标准溶液,0 ℃以下避光保存。
采样容器为棕色玻璃瓶,水样充满样品瓶,样品必须在4 ℃冷藏,并注意避光。地表水及地下水等干净水样可直接进样,废水须经0.45 μ m滤膜过滤后进样。
分析柱(Shim-pack FC-ODS,75 mm×4.6 mm,3 μ m)和保护柱(VanGuardTM BEH C18,1.7 μ m);流动相:0.1%(v/v)甲酸水溶液(A)和甲醇(B),梯度洗脱程序:35%B在5 min内升高至95%B,保持2 min,在0.1 min内降为35%B,平衡5 min;进样量25 μ L;柱温35 ℃;流速0.3 mL/min。
质谱采用ESI正离子模式进行扫描,监测模式为多反应监测(MRM)。离子化参数:离子喷雾电压,5500 V;雾化气为氮气,4.14×105 Pa;辅助气为氮气,4.14×105 Pa;辅助气温度,600 ℃;气帘气,2.41×105 Pa;质谱多反应监测参数见表1。
选择了3种不同材质的滤膜:聚醚砜、尼龙、醋酸纤维,对空白加标样品进行分析,发现尼龙和聚醚砜对样品加标回收无影响,而醋酸纤维对2-萘胺影响较大,加标回收率在50%以下,对其余化合物影响不大,因此选择聚醚砜或尼龙滤膜均可,本文选择了聚醚砜滤膜。
实验过程中发现配制标准溶液使用的溶剂对色谱峰形影响很大,分别用体积分数为0、20% 、30% 、40% 、50% 、100%的甲醇水溶液配制50.0 μ g/L 的混合标准溶液,在上述色谱和质谱条件下进样检测,结果表明,14种苯胺类化合物在6种溶剂条件下的峰面积比较稳定,但峰形差异很大。随着甲醇含量增加,所有化合物的保留时间提前;当甲醇的比例在40%以上时,联苯胺和邻苯二胺峰拖尾,而且峰展宽,响应强度明显降低;当甲醇比例在30%以下时,峰不拖尾;当使用超纯水作溶剂时,所有化合物的峰形对称且尖锐(可能受溶剂效应的影响),故选择超纯水作溶剂。
苯胺类化合物为弱碱类物质,水溶性较强,不同的色谱柱对分离的影响也较大。本文试验了多种色谱柱,如常用的普通C18反相色谱柱①Thermo ODS Hypersil柱(100 mm×2.1 mm,5 μ m)和②Kromasil C18柱(150 mm×2.1 mm,5 μ m),超高效液相色谱柱③Waters Acquity UPLC BEH C18柱(100 mm×2.1 mm,1.7 μ m)和④Shimadzu Shim-pack XR-ODSⅡ柱(75 mm×2.0 mm,2.2 μ m),以及高通量、高分辨的⑤Shimadzu Shim-pack FC-ODS柱(75 mm×4.6 mm,3 μ m)。在流速为0.3 mL/min 时,①和④柱对多种同分异构体化合物分不开,且峰分叉;②柱无法分开对硝基苯胺和对氯苯胺;③柱压太高,超出液相色谱泵的最高输出压力,只能在0.1 mL/min 流速下分析,峰展宽严重,同分异构体化合物(邻甲苯胺和对甲苯胺)分不开;⑤柱可对14种苯胺类化合物进行分离,峰形对称,响应强度高。因此,选择了Shimadzu Shim-pack FC-ODS柱(75 mm×4.6 mm,3 μ m)作为本文的分析柱。
在ODS反相柱上,比较了甲醇-水、甲醇-5 mmol/L 甲酸铵(pH=5.90)、甲醇-10 mmol/L 甲酸铵缓冲溶液(pH=4.0)、甲醇-0.1%(v/v)甲酸(pH=2.92) 4种混合液作为流动相的洗脱效果。结果表明,使用前3种流动相时,色谱峰展宽且严重拖尾,苯胺响应很低,很多同分异构体都没有分开。使用甲醇-0.1%甲酸时,峰形、离子化效率及分离效果均得到明显改善,而且苯胺的响应提高了30倍左右。文献[12]认为酸性条件下,键合相表面未烷基化的硅醇羟基电离被抑制,有机铵改性剂的存在削弱了二次相互作用,改善了峰形。
对流动相中甲酸的含量(0.05% 、0.1% 、0.25% ,v/v)进行了考察,结果表明,当使用0.05%甲酸时,联苯胺和邻苯二胺没有分开,邻甲氧基苯胺和对甲苯胺没有分开,3-氯苯胺和邻硝基苯胺没有分开;当使用0.25%甲酸时,对甲苯胺和邻甲苯胺没有分开,对硝基苯胺与2-萘胺、对氯苯胺3个化合物没有分开;而采用0.1%甲酸时,所有化合物均可以分离。
对甲醇-0.1%甲酸溶液的梯度设置进行试验,甲醇体积分数从30% 、35% 、40% 、50%为起点进行梯度洗脱,发现随着甲醇含量的增加,所有化合物的响应逐渐增强,但当甲醇含量起点增加至40%以上时,所有化合物的分离度变差,其中联苯胺和邻苯二胺没有分开,3-氯苯胺和邻硝基苯胺没有分开。
当把甲醇换为乙腈时,大部分化合物的响应强度降低,特别是联苯胺和对硝基苯胺的响应降低了一个数量级,只有3-硝基苯胺的响应提高了一个数量级。
综上所述,流动相的条件最终选为甲醇-0.1%甲酸(35 ∶ 65,v/v)起始,梯度洗脱,梯度程序见1.3.1节。
在色谱柱和流动相确定的情况下,对柱温进行了考察,主要研究了30、35和40 ℃对化合物的响应和分离度的影响。结果发现,在这3种柱温条件下,化合物的响应没有变化,但分离度不同。当柱温为30 ℃时,对硝基苯胺和2-萘胺分不开,3-硝基苯胺和2,6-二甲基苯胺分不开；40 ℃时3-氯苯胺和邻硝基苯胺分离较差；而35 ℃时,所有化合物都可以得到很好的分离。故选择柱温为35 ℃。
在其他条件确定的情况下,本实验对流动相的流速进行了优化。由于流速太高,离子化效率会降低;流速太低,分析时间长,峰易拖尾,因此在0.2～0.7 mL/min 之间进行比较。结果表明,随着流速降低,苯胺类化合物的响应增强,低至0.2 mL/min 时,对硝基苯胺及后出峰的化合物峰拖尾、展宽,故选择0.3 mL/min 为最佳流速。
将单个标准物质从标准储备液稀释为1.0 mg/L 的标准溶液,对每个化合物进行质谱参数的优化,包括母离子和子离子、去簇电压、入口电压、碰撞池出口电压、碰撞能量的确定。苯胺类化合物结构中含有氨基,属弱碱类,易结合H+带正电荷。优化过程中发现,邻硝基苯胺、间硝基苯胺和对硝基苯胺在负离子扫描模式下也有响应,并找到了母离子和子离子,这3种物质在正离子扫描模式下的响应高于负离子扫描模式,故最终全部选择正离子扫描模式。
在色谱条件和化合物质谱参数确定的情况下,不接色谱柱,将混合标准中间溶液稀释10倍进行自动质谱离子化参数优化,优化参数有:喷雾电压、雾化气、辅助气、辅助气温度、气帘气,最佳参数见1.3.2节。标准溶液的总离子流图见图1。
配制不同质量浓度(0.2、0.5、1.0、2.0、5.0、10.0、20.0、50.0、100.0 μ g/L)的苯胺类混合标准溶液,在优化的色谱和质谱条件下进行分析。以质量浓度为横坐标,峰面积为纵坐标绘制标准曲线。结果显示,间硝基苯胺和邻硝基苯胺在5.0～100.0 μ g/L 范围内线性关系良好,苯胺在0.5～100.0 μ g/L 范围内线性良好,对硝基苯胺在0.2～20.0 μ g/L 范围内线性关系良好,邻甲氧基苯胺在0.2～50.0 μ g/L 范围内线性关系良好,其余9种化合物在 0.2～100 μ g/L 范围内线性关系良好,相关系数均大于0.999(见表2)。
根据《环境监测分析方法标准制修订技术导则》(HJ 168-2010)对检出限试验的要求,对含量为预计检出限2～5倍的空白加标样品进行7次平行测定,按LOD=3.143S(3.143为自由度是6、置信度为99%的t值,S为标准偏差)计算得到方法的检出限,14种苯胺化合物的检出限在0.03～4.19 μ g/L 之间(见表2)。
对地表水水样进行加标,加标质量浓度分别为0.5、5.0、20.0 μ g/L ,每个水平平行测定6次,计算其含量的相对标准偏差(RSD),结果显示,14种苯胺类化合物的RSD在0.4% ～9.4%范围内,见表2。
应用本文建立的方法分析了集中式生活饮用水源地地表水和某垃圾填埋场地下水,并对实际样品进行了加标回收测定,加标量在0.5～50.0 μ g/L 范围内,检测结果见表3。从表3可以看出,地表水和地下水中均未检出14种苯胺类化合物,地表水和地下水中14种苯胺类化合物的加标回收率在68.0% ～130%之间。
该方法也可以检测较干净的废水样品,但在基质复杂的废水样品分析中,由于基质的影响,部分化合物特别是联苯胺和邻苯二胺的回收率偏低(＜50% ),其他12种化合物的回收率在62% ~130%之间,后面的工作将探索采用固相萃取法去除基质干扰。
本文建立了水中14种苯胺类污染物的LC-MS/MS检测方法,该方法灵敏、快速,14种化合物在12 min内分析完毕,检出限在0.03～4.19 μ g/L 之间。将其应用于地表水和地下水的实际样品分析,加标回收率在68.0% ～130%范围内。对于基质复杂的废水样品中部分目标物(邻苯二胺和联苯胺)的检测效果不理想,后面的工作将探索采用固相萃取法去除基质干扰。
国内外研究水质中苯胺类化合物的分析方法主要有分光光度法[ 2 ]、荧光光度法[ 3 ]、气相色谱法[ 4 ]、气相色谱-质谱法[ 5 ]、液相色谱法[ 6 ...
国内外研究水质中苯胺类化合物的分析方法主要有分光光度法[ 2 ]、荧光光度法[ 3 ]、气相色谱法[ 4 ]、气相色谱-质谱法[ 5 ]、液相色谱法[ 6, 7 ]、液相色谱-质谱法[ 8 ...
2015, Vol. 33 Issue (5): 508-513
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