Fe₃O₄磁性纳米粒子采用水热合成法制备^[29]。称取1.35 g的FeCl₃·6H₂O,加入40 mL乙二醇,充分搅拌使块状固体溶解,再加入3.60 g NaAc和1.00 g聚乙二醇,继续搅拌使之形成均一的黏稠液体。然后将混合溶液转移到50 mL的水热合成釜中,密封后放入烘箱,190 ℃下反应8 h。反应结束后用磁铁分离出黑色固体Fe₃O₄磁性纳米粒子,用无水乙醇和去离子水充分洗涤,60 ℃下真空干燥2 h,得到磁性Fe₃O₄磁性纳米粒子。

准确称取0.1 g Fe₃O₄分散于50 mL 0.1 mol/L HCl中,超声10 min,磁性分离出Fe₃O₄并用水充分洗涤,再将其均匀分散于装有60 mL无水乙醇、80 mL水的三口圆底烧瓶中,同时加入0.2 g CTAB和1 mL氨水(质量分数28% ),连续搅拌0.5 h,再将0.5 mL TEOS逐滴加入上述溶液,继续搅拌6 h。搅拌停止后,用磁铁收集产物并用二次水、无水乙醇各洗3次以去除非磁性副产物。最后将纯净的产物加至100 mL丙酮中,75 ℃下回流48 h以去除模板CTAB,再用二次水清洗3次,最终得到介孔Fe₃O₄@mSiO₂。

称取0.56 g介孔Fe₃O₄@mSiO₂分散于20 mL蒸馏水中,再称取0.17 g CuNO₃·3H₂O溶于20 mL蒸馏水并向其中加入1 mL氨水,分别超声30 min。将上述两种液体混合转移至水热反应釜中,密封后放入烘箱140 ℃下加热10 h,冷却至室温,磁性分离,用二次水洗3次,无水乙醇洗3次后,60 ℃下真空干燥2 h,获得最终产物。

色谱柱:Spursil C18色谱柱(250 mm×4.6 mm,5 μ m,Dikma Technologies);柱温:30 ℃;检测波长:238 nm;流速:1.0 mL/min;流动相为乙腈-0.1%(v/v)磷酸水溶液(35 ∶ 65,v/v);进样量:10 μ L。实验依据保留时间定性。MC-LR标准品的色谱图如图1所示。

图1

Fig. 1

图1 Microcystin-LR的高效液相色谱图Fig. 1 HPLC Chromatogram of microcystin-LR

用透射电子显微镜(TEM)和扫描电子显微镜(SEM)观察所合成的样品的晶体形貌与大小。图2a显示出Fe₃O₄@mSiO₂@Cu²⁺磁性纳米粒子的核心是黑色的球体,用水热合成法制备的磁性纳米粒子的平均粒径是250 nm左右,并且表面粗糙。Fe₃O₄@SiO₂磁性纳米粒子的合成不仅保持了Fe₃O₄纳米粒子原有的形态特征,且表面形成孔道均一的介孔,平均粒子也增加到300 nm左右。比较图2a与2b可以明显地看出,磁性纳米粒子外层附着的小颗粒是硅酸铜,但这些小颗粒并没有使磁性纳米粒子的粒径明显变大。

图2

Fig. 2

图2 磁性纳米粒子Fe3O4@mSiO2@Cu2+的 (a)透射电镜和(b)扫描电镜图Fig. 2 Photographs of (a) transmission electron microscope (TEM) and (b) scanning electron microscope (SEM) of Fe3O4@mSiO2@Cu2+ magnetic nanoparticles

结果表明,粒径基本在200～300 nm范围内,在此范围内的磁性纳米颗粒具有很高的比表面积及很强的磁性。介孔二氧化硅壳的合成不仅提高了Fe₃O₄微球的稳定性而且增大了其表面积,松散状的硅酸铜壳更能提高其对MC-LR的吸附量。MC-LR对金属铜离子具有特异选择性识别功能,MC-LR的羧酸基团和酰胺基团可作为金属配位点,形成配位键。基于以上结构，磁性纳米粒子可以高效富集微囊藻毒素。

在室温条件下,向含有MC-LR的样品溶液中加入磁性纳米粒子,对萃取条件进行优化,萃取实验过程如1.3节所述,通过考察MC-LR的回收率来选择最优的萃取条件,对实验中涉及的吸附剂用量、萃取时间、溶液pH值、洗脱剂的选择及用量、洗脱时间等条件都进行了考察。

2.2.1 磁性纳米粒子的用量

分别称取4～16 mg吸附剂,加入100 mL 2.5 μ g/L MC-LR溶液,使磁性吸附剂与样品溶液充分混合,不同质量吸附剂对MC-LR萃取回收率的影响如图3所示。在4～13 mg范围内,随吸附剂加入量的增大,MC-LR的回收率显著增大;当加入13 mg吸附剂时,回收率达到最大;随后当吸附剂的加入量大于13 mg时,MC-LR的回收率并没有随吸附剂的加入量的增加而增大。因此,选择13 mg为磁性介孔Fe₃O₄@mSiO₂@Cu²⁺纳米粒子吸附剂的加入量。

图3

Fig. 3

图3 Fe3O4@mSiO2@Cu2+加入量对MC-LR吸附的影响Fig. 3 Effect of the amount of Fe3O4@mSiO2@Cu2+ on the adsorption of MC-LRExtraction conditions: sample,100 mL 2.5 μ g/L MC-LR; extraction time,90 min. Desorption eluent: 400 μ L,acetonitrile-0.1% (v/v) H3PO4 (3 ∶ 1,v/v); desorption time: 30 min.

2.2.2 萃取时间

萃取时间是固相萃取技术的重要参数之一。当吸附剂与目标物之间未达到吸附平衡时,随着萃取时间的增加,萃取效率通常会增加。同时,在保证富集效果的前提下应该尽量缩短萃取时间。称取13 mg吸附剂加入到100 mL 2.5 μ g/L MC-LR溶液中,分别考察了萃取时间为40、50、60、70、80、90、100、120 min时的萃取效率。结果表明,在1～90 min内,随着萃取时间的延长,MC-LR的萃取回收率逐渐增大;当萃取时间为90 min时,回收率达到最大;之后随着时间的增加,MC-LR的萃取回收率变化不大。基于以上实验结果,我们选择90 min为最佳萃取时间。

图4

Fig. 4

图4 pH对MC-LR吸附的影响Fig. 4 Effect of pH on the adsorption of MC-LR Extraction conditions: Fe3O4@mSiO2@Cu2+,13 mg; MC-LR: 100 mL 2.5 μ g/L; extraction time: 90 min. Desorption eluent: 400 μ L,acetonitrile-0.1% (v/v) H3PO4 (3 ∶ 1,v/v); desorption time: 30 min.

表1

Table 1

表1(Table 1)

表1 Fe3O4@mSiO2@Cu2+在不同pH条件下的Zeta电位 Table 1 Zeta potentials of Fe3O4@mSiO2@Cu2+ with different pHs pH Zeta potential/mV 2 35.34 4 -0.26 6 -12.03 8 -25.83 10 -34.90

表1 Fe3O4@mSiO2@Cu2+在不同pH条件下的Zeta电位 Table 1 Zeta potentials of Fe3O4@mSiO2@Cu2+ with different pHs

在不同的酸性条件下,水中MC-LR的质子化程度不同。配制pH为2～10的一系列水溶液,探讨pH值对萃取回收率的影响。由图4可知,pH 2时萃取回收率最大。这是因为MC-LR的分子中存在两个自由的、可离子化的羧基和一个自由的氨基,这些官能团决定着生物分子MC-LR的带电情况。由于溶液的酸度直接影响着羧基和氨基的带电情况,进而也将直接影响MC-LR分子的表面电位^[30]。表1为吸附剂Fe₃O₄@mSiO₂@Cu²⁺表面电荷分布的情况。当溶液的pH在2～10之间时,MC-LR表面带负电荷^[31]。此时带负电荷的MC-LR更容易被带正电荷的Fe₃O₄@mSiO₂@Cu²⁺吸附。当pH大于4.0时,Fe₃O₄@mSiO₂@Cu²⁺和MC-LR带同种电荷,因此随着pH值的继续增大,吸附效率呈现逐渐下降的趋势。为了考察离子强度对萃取回收率的影响,向水样中加入NaCl来调节溶液的离子强度。NaCl的浓度范围为0.1～0.5 mol/L。实验结果表明,NaCl的加入与否及其浓度变化对MC-LR的萃取回收率几乎没有任何影响。即离子强度对本实验影响不大。

2.2.4 解吸条件

洗脱剂的种类和体积是影响萃取回收率的一个重要因素。本研究考察了甲醇、乙腈、丙酮、异丙醇4种洗脱剂,分别测定了萃取回收率。结果如图5所示,乙腈的洗脱效果最优。又进一步考察了乙腈-0.1% (v/v) H₃PO₄ (9 ∶ 1,v/v)、乙腈-0.1% (v/v) H₃PO₄ (3 ∶ 1,v/v)、乙腈-0.1% (v/v) H₃PO₄ (1 ∶ 1,v/v)、乙腈-0.1% (v/v) H₃PO₄(1 ∶ 3,v/v)4种洗脱剂,同时与上述其他3种类型分别用同样方式处理后的洗脱剂进行了比较,综合考虑还是稀释后的乙腈萃取效果最好,萃取回收率分别为70% 、82% 、69% 、65% 。乙腈-0.1% (v/v) H₃PO₄ (3 ∶ 1,v/v)的洗脱效果最好,说明酸性条件促进MC-LR多肽羧酸基团的质子化,使MC-LR更易于从吸附剂上洗脱下来,故选择乙腈-0.1% (v/v) H₃PO₄ (3 ∶ 1,v/v)为最终的洗脱剂。

图5

Fig. 5

图5 不同类型的洗脱剂对MC-LR解吸的影响Fig. 5 Effect of different eluents on the desorption of MC-LR Extraction conditions: Fe3O4@mSiO2@Cu2+,13 mg; MC-LR: 100 mL 2.5 μ g/L (pH 2); extraction time: 90 min. Desorption elution volume: 400 μ L,desorption time: 30 min.

为了确定所用乙腈-0.1% (v/v) H₃PO₄(3 ∶ 1,v/v)的洗脱体积,分别使用200、400、600 μ L,得到MC-LR的萃取回收率分别为74% 、81% 、83% 。结果表明,当洗脱剂的体积为400 μ L时,洗脱效果较好;随着洗脱体积增大回收率增大,但随之浓缩时间也加大。综合考虑选择400 μ L为洗脱剂的体积。

此外,实验还考察了不同的解吸时间(10～50 min)对解吸效果的影响。通过实验发现,在1～30 min内随着解吸时间的增加,MC-LR的回收率逐渐增加,30 min后几乎不再变化。说明30 min时基本达到解吸平衡。所以选择30 min作为解吸时间。

在上述最优条件下对该方法进行了评价。在0.1～15 μ g/L 范围内MC-LR的峰面积y与质量浓度x( μ g/L)线性回归方程为y=20081x-436.22(y:峰面积; x:质量浓度,μ g/L),线性良好,相关系数(r)为 0.999 4。以S/N为3和10分别确定检出限(LOD)和定量限(LOQ),结果为0.025 μ g/L 和0.082 μ g/L。将质量浓度为5 μ g/L 的样品溶液(平行6个),经过MSPE处理,浓缩进行色谱分析,计算求得MC-LR峰面积的RSD为5.2% ,表明该方法具有良好的重现性。

根据以上优化实验确定MSPE前处理的条件为:13 mg Fe₃O₄@mSiO₂@Cu²⁺纳米粒子加入到100 mL 0.25 μ g/L 样品溶液(pH 2)中,经涡流振荡萃取90 min后用400 μ L乙腈-0.1% (v/v) H₃PO₄(3 ∶ 1,v/v)洗脱磁性纳米粒子,超声辅助解吸30 min后收集洗脱液,经氮气吹干,用超纯水定容至200 μ L。为评价该方法的准确性和应用价值,进样前用MSPE方法处理,得到色谱图(见图6)。萃取后MC-LR的质量浓度为0.195 μ g/L,回收率达到78% 。结果显示,MSPE样品前处理技术富集水样中痕量MC-LR能得到令人满意的效果。

图6

Fig. 6

图6 MC-LR(0.195 μ g/L)在最优的MSPE萃取条件下的色谱图Fig. 6 Chromatogram of MC-LR (0.195 μ g/L) at the optimal MSPE extraction conditions Extraction conditions: Fe3O4@mSiO2@Cu2+,13 mg; MC-LR: 100 mL 2.5 μ g/L (pH 2); extraction time: 90 min. Desorption eluent: 400 μ L acetonitrile-0.1% (v/v) H3PO4 (3 ∶ 1,v/v); desorption time: 30 min.