Agilent 1290高效液相色谱仪、Agilent 6490串联质谱仪(美国Agilent公司),涡旋混合仪(美国Scientific Industries公司),KQ-500DE数控超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司),Avanti J-26 XPI离心机(美国Beckman Coulter公司),超纯水系统(美国Millipore Milli-Q Gradient公司),Sep-Park-C₁₈固相萃取柱(美国Agilent公司),Oasis WAX、Oasis HLB、Sep-Park Vac固相萃取柱(美国Waters公司)。

甲醇、乙腈、乙酸、甲酸铵和乙酸铵(色谱纯,美国Fisher Scientific公司);儿茶酚(纯度≥99.8% ,美国Fluka公司)。

色谱柱Agilent Eclipse Plus C₁₈(50 mm×2.1 mm,1.7 μ m),流动相A为0.2%(v/v)甲酸水溶液,B为甲醇;梯度洗脱程序:0～1.5 min,20%B; 1.5～3.0 min,20%B～90%B; 3.0～4.0 min,90%B～20%B; 4.0～4.5 min; 20%B。

电喷雾负离子扫描(ESI^-)模式;毛细管电压:3 500 V;雾化器压力:137.9 kPa(20 psi);鞘气温度:300 ℃;鞘气流量:11 L/min;干燥气(氮气)温度:250 ℃;干燥气流量:15 L/min;采集方式:多反应监测(MRM)模式;儿茶酚的母离子:m/z 109.0;子离子:定性离子为m/z 91.0,碰撞能量为20 eV;定量离子为m/z 64.8,碰撞能量为25 eV。

称取2.0 mg(精确至0.1 mg)儿茶酚标准品于10 mL容量瓶中,以甲醇定容,配成200 mg/L 的标准储备液。准确移取上述标准储备液,以甲醇稀释得到所需浓度的标准溶液。

准确称取10.0 g烟样(精确至0.1 g),加入150 mL浓度为2.5 mol/L 的硫酸,加热回流70 min后转入蒸馏烧瓶中,水蒸气蒸馏15 min,收集馏分,定容到250 mL,取30 mL加入0.05 g乙酸铵,用乙酸调节pH至6后,以3 mL/min 速度上样至C₁₈固相萃取柱富集,固相萃取柱抽真空至近干后,用5 mL 60%(v/v)甲醇水溶液以3 mL/min 洗脱,洗脱液过0.22 μ m有机膜后,取5 μ L进样分析。

烟草中的酚类物质多以结合态存在,测定之前需将结合态的酚游离出来。本实验参照文献^[11]的方法使用2.5 mol/L 的硫酸加热回流,然后水蒸气蒸馏分离得到样品溶液。

2.1.1 回流时间的优化

实验考察了30～90 min范围内不同回流时间对烟草中酚类物质游离效果的影响。图1表明60 min以后回收率趋于平稳,基本不变。本研究选取70 min。

图1

Fig. 1

图1 回流时间与游离酚回收率的关系 Fig.1 Relationship between refluxing time and recovery

2.1.2 固相萃取条件的优化

实验采用SPE真空提取装置,考察了不同种类的固相萃取柱对回收率的影响,结果表明Sep-Pak-C₁₈固相萃取柱对儿茶酚的萃取效果最优,不同类型的固相萃取柱对儿茶酚的萃取效率从高到低依次为Sep-Pak-C₁₈(82.3% )、Oasis HLB(50.1% )、Sep-Pak Vac(20.1% )、Oasis WAX(19.2% ),故本实验选用Sep-Pak-C₁₈固相萃取柱。

由于酸性条件下酚类物质在C₁₈柱上有较好的保留,李忠等^[11]使用磷酸二氢钾保持样品的酸性使酚的电离被抑制,考虑到不挥发性盐不适用于质谱,用15 mL甲醇和0.1 mol/L 乙酸溶液活化固相萃取柱以保持柱为酸性。因为缓冲盐浓度较高时,在电喷雾系统中有强烈的竞争性离子化作用,对电喷雾有明显负作用,从而导致离子抑制效应,使得待测物的灵敏度明显降低。所以在样品提取液中加入乙酸铵0.05 g,然后再用0.1 mol/L 乙酸调节样品pH值为6保持其酸性,以3 mL/min 流速上样。

实验比较了不同洗脱剂对儿茶酚的洗脱效果,结果发现四氢呋喃或甲醇-水溶液都能使儿茶酚完全洗脱,但四氢呋喃会导致其他干扰组分也被洗出反而干扰测定,所以实验选用甲醇-水洗脱。我们考察了不同甲醇体积分数(20% 、40% 、60% 、80% )的甲醇水溶液对洗脱效率的影响,其回收率结果依次为36% 、67% 、89%和78% ,当甲醇的体积分数为60%时回收率最大。因此选用60%(v/v)甲醇水溶液作洗脱剂。这样能使儿茶酚完全洗脱,又能较好地去除其他干扰组分。实验结果还表明用5 mL 60%甲醇水溶液以3 mL/min 洗脱可使儿茶酚洗脱完全。

图2给出了优化固相萃取条件前后样品的总离子流色谱图。可以看出,净化后色谱峰形得到了改善,净化效果明显。

图2

Fig. 2

图2 (a)未使用和(b)使用C18固相萃取柱净化的样品的总离子流色谱图 Fig.2 Total ion current chromatograms of a sample (a) before and (b) after cleanup with C18

弱酸性流动相可使酚的电离被抑制从而改善分离效果和峰形,但是如果酸性太强则会损害色谱柱。 实验分别比较了甲醇和0.1%(v/v)的甲酸水溶液、甲醇和0.2%(v/v)的甲酸水溶液、乙腈和0.1%(v/v)的甲酸水溶液3种组合对同等含量儿茶酚样品的分离测定效果的影响。图3表明采用甲醇和0.2%(v/v)的甲酸水溶液作为流动相时分离效率最优。

图3

Fig. 3

图3 3种流动相条件下儿茶酚的总离子流色谱图 Fig.3 Total ion current chromatograms of catechol with three different mobile phases Mobile phases: 1. acetonitrile and 0.1% formic acid in water; 2. methanol and 0.1% formic acid in water; 3. methanol and 0.2% formic acid in water.

实验对流动相不同梯度条件下的分离效率也进行了考察,结果发现在1.2节的梯度洗脱条件下可获得最佳的分离效率。

分别在ESI⁺、ESI^-扫描模式下,对100 μ g/L 的标准溶液进样进行扫描,结果表明,只有在ESI^-扫描模式下的电喷雾离子化能使儿茶酚产生m/z 109.0的准分子离子峰(见图4)。分别对准分子离子进行子离子扫描,通过优化碰撞能量使其强度最大,选择母离子和两个子离子作为特征离子,并将其中一个信号大的子离子作为定量离子,由此得到儿茶酚的母离子为m/z 109.0;定性离子为m/z 91.0,碰撞能量为20 eV;定量离子为m/z 64.8,碰撞能量为25 eV。

图4

Fig. 4

图4 儿茶酚在ESI+、ESI-全扫描模式下的全扫描质谱图 Fig.4 Mass spectra of catechol in full scanning mode (ESI+/ESI-)

本实验采用基质匹配法做标准曲线进行定量。分别向空白卷烟样品中添加儿茶酚的标准储备液,制成含量分别为0.5、1、2、5、10、20、50、100和200 μ g/kg 的系列加标样品,按前述方法分别进行样品前处理和测定(每个含量的样品测定6次),以目标物的峰面积Y对其含量X( μ g/kg)进行回归分析,得到儿茶酚的线性回归方程Y=2 337.5X+10.17,线性范围为0.5～200 μ g/kg,相关系数(r²)为 0.998 9。以信噪比为3时定量离子信号对应的样品含量为检出限(LOD),以信噪比为10时定量离子信号对应的样品含量为定量限(LOQ),结果表明,LOD和LOQ分别为0.4 μ g/kg 和1.3 μ g/kg。

以空白卷烟样品进行加标回收实验,添加水平分别为5、10和20 μ g/kg,连续3天测定,每个水平做6个平行样品。结果表明儿茶酚在5、10和20 μ g/kg 3个加标水平的平均回收率依次为83.1% 、87.9%和98.6%,日内相对标准偏差(RSD)依次为5.8% 、2.7%和1.9% ,日间RSD依次为6.5% 、4.1%和3.3% 。

分别对6种实际样品(S1～S6)中的目标物进行了测定,对每个样品重复测定6次,6种卷烟样品中均含有不同量的儿茶酚,含量分别为(15.3±0.6)、(71.2±1.4)、(88.1±0.9)、(60.3±1.4)、(27.1±0.6)和(80.5±1.3) μ g/kg,这表明对商品卷烟中儿茶酚的检测和监控十分必要。