色谱  2015, Vol. 33 Issue (5): 455-460   PDF (3265 KB)    
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杨然存
张少文
孙雨安
溶胶-凝胶杂化整体柱修饰及在多环芳烃检测中的应用
杨然存1,2, 张少文2 , 孙雨安1     
1. 郑州轻工业学院, 河南 郑州 450000;
2. 洛阳理工学院, 河南 洛阳 471023
收稿日期：2015-01-21
基金项目：河南省科技发展计划项目(122102310333,1223041346);河南省教育厅基础前沿项目(13A150793).
通讯作者：Tel:(0379)65928267,E-mail:zhsw155@163.com(张少文);E-mail:sya371@163.com(孙雨安).
摘要：利用点击反应对含叠氮基的溶胶-凝胶整体柱进行了表面修饰,制备了C6-硅胶杂化整体萃取柱。实验以多环芳烃为分析对象,考察了制备和修饰条件对萃取效率的影响,在优化的条件下,新制备的整体柱对萘、菲、芘和苯并[a]芘的萃取富集倍数分别达到95.9、114.2、103.2和57.8。萃取实验的日内和日间精密度(RSD)分别小于5.5%(n=8)和7.3%(n=10)。建立的管内固相微萃取-高效液相色谱检测16种常见多环芳烃方法的检出限(S/N=3)达到0.08~3.72 μg/L,定量限(S/N=10)达到0.26~12.40 μg/L。土壤中多环芳烃分析的加标回收率为82.4%~110.6%, RSD为2.6%~7.9%(n=3)。与美国国家环境保护局检测土壤中多环芳烃的方法比较,结果一致,准确性高。实验表明,该方法萃取效率高,灵敏可靠,操作简便,重现性好,可满足土壤等样品中痕量多环芳烃检测的要求。
关键词： 点击反应     硅胶杂化整体柱     管内固相微萃取     高效液相色谱     多环芳烃    
Modification of sol-gel hybrid monolith and its application in determination of polycyclic aromatic hydrocarbons
YANG Rancun1,2, ZHANG Shaowen2 , SUN Yu'an1     
1. Zhengzhou University of Light Industry, Zhengzhou 450000, China;
2. Luoyang Institute of Science and Technology, Luoyang 471023, China
Received: 2015-01-21
Abstract: A C6-silica hybrid monolithic column was prepared by click reaction with capillary silica monolith. Firstly, an azide-functionalized silica monolithic column was synthesized via sol-gel reaction with tetramethoxysilane (TMOS) and 3-azidopropyltrimethoxysilane (N3PTMS). Then 1-hexyne was covalently immobilized on the capillary monolith by the "azide-alkyne" click reaction to form C6-silica hybrid monolithic column. As an extraction media of polycyclic aromatic hydrocarbons (PAHs), the conditions for the preparation and modification of the monolith were carefully investigated according to the extraction efficiency. The enrichment factors for typical PAHs: naphthalene, phenanthrene, pyrene and benzo[a]pyrene finally reached 95.9, 114.2, 103.2 and 57.8, respectively. The relative standard deviations (RSDs) for the extraction were lower than 5.5% (intra-day, n=8) and 7.3% (inter-day, n=10). Based on the in-tube solid phase microextraction (in-tube SPME), a new determination method for 16 PAHs was developed with high performance liquid chromatography (HPLC). The limits of detection (LODs, S/N=3) were 0.08-3.72 μg/L and the limits of quantification (LOQs, S/N=10) were 0.26-12.40 μg/L for the PAHs. The spiked recoveries for the PAHs in soil samples were between 82.4% and 110.6% with the RSDs (n=3) of 2.6%-7.9%. Comparison with the method of United States Environmental Protection Agency (U. S. EPA) for the PAHs determination in soil samples, the results showed good accuracy and high consistency. And the high extraction efficiency with high sensitivity and convenience was also demonstrated in the applications of the new approach.
Key words: click reaction     silica hybrid monolith     in-tube solid phase microextraction (SPME)     high performance liquid chromatography (HPLC)     polycyclic aromatic hydrocarbons (PAHs)    

溶胶-凝胶整体柱具有性能稳定、机械强度和通透性较好、pH适用范围宽等特点,是固相微萃取(solid phase micro-extraction,SPME)的理想介质。然而,由于溶胶-凝胶柱功能性修饰困难,从而限制了其在环境、食品、生物、医学等复杂样品检测中的应用[1,2,3]。土壤中多环芳烃(PAHs)的迁移、积累是环境科学研究的热点,样品检测需经快速溶剂萃取、柱层析净化,氮吹浓缩及溶剂置换等过程,操作繁琐,且耗时较长[4,5,6],因此需要研究开发新的便捷、高效的萃取材料和检测方法。

点击反应(click reaction)以操作简单、条件温和、产率高、选择性好等优点备受关注[7,8,9,10],主要包括巯-烯反应和叠氮-端基炔环加成反应两种类型。如利用巯-烯反应,在整体柱上引入咪唑、十八硫醇、3-丙烯酰胺基苯硼酸等功能基团,改善了柱性能,成功用于烷基苯等化合物的分离[11,12,13]。利用叠氮-端基炔环加成反应,在一价Cu(Ⅰ)催化下将癸炔修饰到表面,得到疏水性整体柱,用于牛血清白蛋白(BSA)等5种蛋白质的分析,提高了选择性和检测灵敏度[14]。

本文以四甲氧基硅烷(TMOS)和(3-叠氮基)三甲氧基硅烷(N3PTMS)作为前驱体,采用溶胶-凝胶反应制备含叠氮基的整体柱,然后通过点击反应修饰得到C6-硅胶杂化整体柱。以此为萃取介质,结合高效液相色谱(HPLC)建立了土壤中多环芳烃的分析检测方法。

1 实验部分
1.1 仪器与试剂
1.1.1 仪器

1260 Infinity高效液相色谱仪(HPLC)(美国安捷伦科技有限公司); Nicolet 5700红外光谱仪(美国Thermo Nicolet公司); JSM-6490LV扫描电子显微镜(日本电子株式会社); LSP04-1A注射泵(保定兰格恒流泵有限公司); MS-H-Pro+磁力搅拌器(北京大龙兴创实验仪器有限公司); KQ5200型超声清洗器(昆山市超声仪器有限公司); ASE200快速溶剂萃取仪(美国戴安公司)。

1.1.2 试剂

TMOS(纯度98% )和(3-氯丙基)三甲氧基硅烷(ClTMS,纯度98% )购自武汉大学有机硅新材料股份有限公司;N,N-二甲基甲酰胺(DMF，分析纯)、聚乙二醇(PEG,Mr=10 000)、碘化钾及乙酸购自国药集团;尿素购自天津市德恩化学试剂有限公司;碘化亚铜购自上海振兴试剂厂;N,N,N′,N″,N″-五甲基二亚乙基三胺(PMDETA,纯度98% )，1-己炔(纯度97% )，萘(Nap)、菲(Phe)、芘(Pyr)和苯并[a]芘(BaP)均为分析纯,购自日本东京化成工业株式会社;16种多环芳烃混合标准储备液购自美国SUPELCO公司。

弹性石英毛细管(内径320 μ m)购自河北永年锐沣色谱器件有限公司。

1.1.3 多环芳烃标准溶液的配制

中间标准储备溶液:取16种多环芳烃混合标准储备液1.00 mL,用甲醇稀释并定容到100 mL容量瓶中,配制成中间标准储备溶液。

标准工作溶液:分别取上述中间标准储备液0.01～10.00 mL于100 mL容量瓶中,用甲醇/水(10 ∶ 90,v/v)溶液稀释并定容,配制系列浓度的混合标准工作液,于4 ℃下保存备用。

1.2 有机-硅胶杂化整体柱的制备
1.2.1 前驱体N3PTMS的合成

在250 mL三颈烧瓶中加入120 mL干燥的DMF、叠氮化钠(9.75 g,150 mmol)、碘化钾(0.17 g,1.02 mmol),通氮气保护,于100 ℃下回流,滴加(3-氯丙基)三甲氧基硅烷(19.87 g,100 mmol)。24 h后停止反应并冷却至室温,减压蒸馏除去DMF。加入50 mL乙醚和20 mL水,静置分层,有机相用20 mL水洗涤5次至无色透明,加无水硫酸镁干燥,过滤后减压蒸馏(92 ℃,666～800 Pa),收集得到N3PTMS无色透明油状液体16.28 g。

1.2.2 叠氮基-硅胶整体柱的制备

叠氮基硅胶整体柱(N3-硅胶整体柱)参考文献[15,16,17]制备。毛细管的预处理:充入1 mol/L NaOH溶液,密封两端,于40 ℃下反应3 h,然后依次用1 mol/L HCl、水冲洗,洗至中性后通氮气干燥密封备用。

将1.50 mL TMOS与0.50 mL N3PTMS混合,取1.80 mL加至含0.20 g PEG和0.40 g尿素的4.0 mL乙酸(0.01 mol/L)溶液中,于0 ℃下剧烈搅拌1 h,得到透明均一溶液。超声1 min,经0.45 μ m滤膜过滤后注入处理过的毛细管中,用硅胶垫密封两端,置于40 ℃烘箱中反应20 h,随后逐渐升温至120 ℃并保持3 h。反应结束后分别用水、甲醇冲洗整体柱以除去致孔剂和残余试剂。

1.2.3 C6-硅胶杂化整体柱的制备

利用CuI催化叠氮-端基炔(CuAAC)反应将1-己炔键合到N3-硅胶整体柱上。将CuI(0.05 g,0.26 mmol)、PMDETA 1.0 mL和1-己炔(0.40 g,4.9 mmol)溶于5.0 mL DMF中,超声使之充分混合。混合液注入整体柱,密封两端,于60 ℃下反应20 h。然后依次用适量的乙腈、50 mmol/L EDTA和水冲洗,即得C6-硅胶杂化整体柱。

1.3 管内固相微萃取

萃取装置参见文献[18]。将C6-硅胶杂化整体柱(65 mm×320 μ m)固定在5 mL注射器针头上,用注射泵驱动输送样品溶液。

萃取实验中首先用1 mL丙酮和水分别冲洗活化整体柱,然后取1.00 mL样品溶液以200 μ L/min 恒速通过整体柱进行萃取,以N2吹扫除去残液;最后用丙酮解吸富集样品,定量收集洗脱液进行HPLC分析。

1.4 色谱条件

液相色谱分析采用SUPELCOSIL LC-PAH专用柱(25 cm×4.6 mm,5 μ m),柱温30 ℃,可变波长紫外检测器检测波长254 nm,进样量10 μ L。流动相A为甲醇,B为水;梯度洗脱程序:0～5.0 min,80%A; 5.0～20.0 min,100%A;流速1.0 mL/min。

2 结果与讨论
2.1 N3-硅胶整体柱制备条件的优化

C6-硅胶杂化整体柱的制备过程如图1所示。其中TMOS与N3TMS的比例及混合液中聚乙二醇、尿素和乙酸的相对含量等对杂化整体柱的外观形貌、机械性能、富集效率均有较大的影响,本实验对此进行了详细考察。

图1 CuAAC反应制备C6-硅胶杂化整体柱Fig. 1 Preparation of C6-silica hybrid monolith via CuAAC reaction

TMOS和N3PTMS的用量是成功制备硅胶整体柱的关键因素。实验中发现,当TMOS与N3PTMS的体积比为3 ∶ 1时,混合物在冰水浴中搅拌1 h可形成均一透明的溶液;进一步增加活性单体N3PTMS的量,难以形成均匀的水解溶液。

乙酸可调节硅烷试剂的水解及凝胶过程,并对柱床强度和骨架的形貌有一定的影响[19],经实验优化,加入4.00 mL 0.01 mol/L 乙酸时,所制得的整体柱均匀连续、结实耐用。

PEG的用量控制整体柱的通孔和骨架尺寸,决定反应中的相分离过程,影响整体柱的结构和性能[20]。当PEG用量为0.10 g时,形成的整体柱骨架疏松,管内不能完全充实;当PEG用量为0.20 g时,整体柱骨架均匀,机械性能稳定;当PEG用量为0.30 g时,整体柱会出现脱壁现象。因此选择PEG的合适用量为0.20 g。

尿素受热分解产生NH3,经硅胶低聚单元溶解-再沉淀形成中孔,其用量影响柱的比表面积,进而影响整体柱的萃取效率[21,22]。实验以典型的PAHs(萘、菲、芘、苯并[a]芘)为分析对象，考察了不同尿素用量对制备整体柱萃取效率的影响,结果如图2所示。随着尿素用量的增加,硅胶柱对PAHs的萃取效率逐步升高;当尿素用量为0.40 g时,萃取效率最高、性能最佳;当尿素用量大于0.40 g时,整体柱通透性变差,萃取效率下降。因此实验选择尿素用量为0.40 g。

图2 尿素对整体柱萃取性能的影响Fig. 2 Effect of urea addition on the extraction efficiency of monolithExtraction conditions: sample solvent,1.00 mL 10%(v/v) methanol solution; extraction rate,200 μ L/min; elution solvent,acetone; elution rate,50 μ L/min.
2.2 C6-硅胶杂化整体柱制备条件的优化

N3-硅胶整体柱的N3 -基团与1-己炔通过CuAAC反应,在硅胶表面键合C6 基团,从而制成C6-硅胶杂化整体柱,如图1所示。实验中以提高PAHs的萃取效率为目标,优化了整体柱修饰反应的相关条件。

温度对点击反应有直接影响。温度过低,能量不足以使更多的端基炔与叠氮基键合;温度过高,1-己炔因沸点低(71 ℃)而易挥发,影响与Cu+的配合反应。实验考察了温度对修饰的整体柱萃取性能的影响。在40～60 ℃时，随着温度的升高,修饰的整体柱对PAHs的萃取效率相应升高;60 ℃时,对PAHs的萃取效率最高;超过70 ℃时,萃取效率降低(见图3)。因此将修饰反应温度设定为60 ℃。

图3 温度对整体柱萃取性能的影响(PAHs为分析物)Fig. 3 Effect of temperature on the extraction efficiency of monolith for PAHsThe extraction conditions are the same as in Fig. 2.

修饰过程中各成分的相对含量对萃取效率也有较大的影响。通过反复优化,当CuI为0.05 g(0.26 mmol)、PMDETA为1.0 mL和1-己炔为0.40 g(4.9 mmol)、DMF为5.0 mL时,C6-硅胶杂化整体柱对PAHs的萃取性能最佳。

实验借助傅里叶变换红外光谱(FT-IR)考察了C6-硅胶杂化整体柱的修饰效果。图4a为N3-硅胶整体柱的红外吸收曲线,图4b为C6-硅胶杂化整体柱的红外吸收曲线。修饰后整体柱在 2 101 cm-1处的吸收峰(N3 -)明显减弱,2 958 cm-1、2 928 cm-1和2 863 cm-1处的吸收峰(CH3 -,CH2 -)增强,表明C6 -基团已成功键合到硅胶整体柱上。另外,N3 -基团的吸收峰在修饰后并没有完全消失,于是将修饰后的整体柱进行再修饰,结果红外谱图差别不大,表明整体柱表面的N3 -基团已基本被C6 -基团取代,修饰反应进行得较为完全。

图4 (a)N3-硅胶整体柱与(b)C6-硅胶杂化整体柱的红外图谱Fig. 4 FT-IR spectra of (a) N3-monolith and (b) C6-silica hybrid monolith

用扫描电镜对修饰后整体柱的形貌特征进行了考察。图5a为整体柱的截面图,图5b为局部形貌图。从图5中可以看出C6-硅胶杂化整体柱的柱体与毛细管管壁结合紧密,无脱壁现象,硅胶骨架交联成网状,孔径均匀,连续贯通,保证了整体柱良好的通透性,可进行有效传质,为改善萃取性能奠定了基础。

图5 C6-硅胶杂化整体柱的(a)截面和(b)局部的扫描电镜图Fig. 5 Scanning electron micrographs of C6-silica hybrid monolith of (a) cross section and (b) part
2.3 管内固相微萃取条件

以萘、菲、芘、苯并[a]芘为分析对象,实验优化了管内固相微萃取的主要操作条件:萃取溶剂、萃取速率、洗脱液类型和洗脱速率等。筛选的萃取条件为:萃取溶剂为甲醇/水(10 ∶ 90,v/v),萃取速率为200 μ L/min,洗脱液为丙酮,洗脱速率为50 μ L/min,洗脱液收集最佳体积为10 μ L。

2.4 萃取效率

实验以PAHs的富集倍数为指标，考察了C6-硅胶杂化整体柱的萃取性能。选取 1 000 μ g/L 萘、200 μ g/L 菲、200 μ g/L 芘、80 μ g/L 苯并[a]芘标准品为分析对象,通过C6-硅胶杂化整体柱对其进行萃取实验,以萃取后分析物浓度与原标准溶液中分析物浓度的比值为萃取的富集倍数。在优化的实验条件下,C6-硅胶杂化整体柱对萘、菲、芘、苯并[a]芘的富集倍数(3次平均值)达到95.9、114.2、103.2和57.8。整体柱对PAHs有较好的萃取富集能力,表明C6-硅胶杂化整体柱与PAHs之间存在较强的相互作用,这可能主要为三氮唑基团与PAHs之间的 π - π 电子作用及C6 -与PAHs的分子间力。同时,C6-硅胶杂化整体柱对PAHs的富集效率随PAHs环数的增加呈先升后降趋势,其中对菲的富集能力最大,这可能与PAHs的分子体积有关。

2.5 重现性

C6-硅胶杂化整体柱萃取的重现性是影响分析方法可靠性的重要因素。实验考察了日内与日间整体柱萃取富集的精密度(见表1)。结果表明,对典型PAHs富集的日内和日间RSD为3.0% ～5.5%(n=8)和5.1% ～7.3%(n=10),可见方法的重现性较好,满足定量分析的要求。

表1 C6-硅胶杂化整体柱的重现性 Table 1 Reproducibilities of the C6-silica hybrid monolith
2.6 分析方法的考察

实验以C6-硅胶杂化整体柱为萃取介质,结合高效液相色谱建立了管内固相微萃取-高效液相色谱(in-tube SPME-HPLC)检测PAHs的方法,并对16种常见的多环芳烃进行分析。实验获得了PAHs的标准曲线、线性范围、检出限(LOD)、定量限(LOQ)等,结果见表2。其中LOD和LOQ分别取信噪比为3和10进行计算,16种多环芳烃的LOD为0.08～3.72 μ g/L,LOQ为0.26～12.4 μ g/L;以PAHs的峰面积(Y)对其质量浓度(X,μ g/L)进行回归分析,相关系数R2≥0.990 4,可见方法在较宽的范围内线性关系良好。图6a为利用in-tube SPME-HPLC对10 μ L PAHs标准溶液萃取富集后的色谱图,图6b为10 μ L标准溶液直接测定的色谱图,由色谱图对比可知,C6-硅胶杂化整体柱对PAHs有很好的萃取富集性能。

表2 16种PAHs的线性方程、相关系数、线性范围、检出限和定量限 Table 2 Regression equations,correlation coefficients (R2),linear ranges,LODs and LOQs for the 16 PAHs

图6 (a)经管内固相微萃取和(b)未经管内固相微萃取分析PAHs标准溶液的色谱图Fig. 6 HPLC chromatograms of PAHs standard solution (a) with in-tube SPME and (b) without in-tube SPME Analytical conditions: mobile phase A,methanol; mobile phase B,water; gradient: 0-5.0 min,80%A; 5.0-20.0 min,100%A; flow rate: 1.0 mL/min; oven temperature: 30 ℃; UV: 254 nm.
Peak identifications: 1. naphthalene; 2. acenaphthylene; 3. acenaphthene; 4. fluorene; 5. phenanthrene; 6. anthracene; 7. fluoranthene; 8. pyrene; 9. benzo[a]anthracene; 10. chrysene; 11. benzo[b]fluoranthene; 12. benzo[k]fluoranthene; 13. benzo[a]pyrene; 14. dibenz[a,h]anthracene; 15. benzo[g,h,i]perylene; 16. indeno[1,2,3-cd]pyrene.
2.7 实际土壤样品分析

实验采用新建方法测定了湖南红色土壤(red soil)、东北黑色土壤(black soil)、重庆紫色土壤(purple soil)中的PAHs含量,并与采用美国国家环境保护局(U. S. EPA)前处理方法[23,24,25]的分析结果进行了对比,由表3可见in-tube SPME方法与EPA的测定结果相近。但in-tube SPME简化了前处理过程,缩短了测定样品所需的时间。

表3 两种分析方法测定土壤样品中PAHs含量结果的比较 Table 3 Comparison of determination results of the PAHs in soil samples by this method (in-tube SPME) and EPA method

实验考察了方法的加标回收率。分别向3种土壤样品中加入不同水平的混合标准溶液,按本文建立的方法进行样品处理和分析,方法的回收率为82.4% ～110.6% ,RSD为2.6% ～7.9%(n=3)。结果表明该方法准确度高、实用可靠,适用于土壤中痕量PAHs的分析。

3 结论

本文采用叠氮-端基炔反应对溶胶-凝胶制备的毛细管整体柱进行了表面修饰,通过优化实验条件,制得结构均匀、致密通透、对多环芳烃具有较高萃取富集效率的硅胶杂化整体柱。以此为介质,建立了管内固相微萃取-高效液相色谱检测PAHs的方法。方法灵敏可靠、操作简便、重现性好,具有较好的实用性,能够满足土壤中痕量PAHs分析的要求。

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