准确量取MMP、MEP、MBP、MBzP、MEHP、MEHHP和MEOHP及其¹³C标记单酯的标准品原液1 mL于10 mL容量瓶中,乙腈定容,配制为10.0 mg/L 的单标准储备液和内标单标准储备液。

准确量取10.0 mg/L 各单标准储备液1 mL于同一10 mL容量瓶中,乙腈定容,配制1.0 mg/L 的混合标准工作液;同时配制1.0 mg/L 的内标混合标准工作液,操作步骤同上。

准确量取1.0 mg/L 内标混合标准工作液1 mL于干净的50 mL容量瓶中,加入LC-MS级乙腈9 mL,LC-MS级水定容,配制为20.0 μ g/L 的混合内标定容液。

准确量取1.0 mg/L 混合标准工作液2 mL于10 mL容量瓶中,加入0.2 mL内标混合标准工作液(1.0 mg/L),LC-MS级水定容,配制为200.0 μ g/L 的标准溶液;此后逐级稀释,采用20.0 μ g/L 混合内标定容液定容,配制100.0、50.0、25.0、10.0、5.0、1.0、0.2 μ g/L 的系列标准溶液,保证溶液中¹³C-内标物浓度均为20.0 μ g/L。

色谱柱:Agilent ZORBAX SB-Phenyl(100 mm×2.1 mm,3.5 μ m);流动相:A相为0.1%(v/v,下同)乙酸水溶液,B相为0.1%乙酸乙腈溶液。洗脱梯度:0～8 min,20%B～50%B; 8～13 min,50%B～60%B; 13～17 min,60%B; 17～19 min,60%B～90%B; 19～21 min,90%B; 21～23 min,90%B～20%B; 23～27 min,20%B。流速为0.2 mL/min;柱温35 ℃;连续自动进样,进样量为10 μ L。

电喷雾离子源负离子模式(ESI^-);毛细管电压为 4000 V;雾化气压力为275.8 kPa,干燥气温度为300 ℃,流速为9.0 L/min;多反应监测(MRM)模式检测;碰撞气和载气均为高纯氮气。7种PAEs及其内标物的定量离子对、保留时间、碎裂电压、碰撞能量等质谱参数见表1。

表1

Table 1

表1(Table 1)

表1 7种邻苯二甲酸单酯及其内标的特征离子对、碎裂电压、碰撞能量和保留时间等质谱参数 Table 1 Precursor and product ion transitions,fragmentors,collision energies and retention times (RT) of the native and labeled seven phthalate metabolites Analyte Precursor ion (m/z) Product ions (m/z) Fragmentor/eV Collision energy/V RT/min MMP 179 77.2*,107.1 79 13 4.714 13C-MMP 183 79.1*,109.1 69 13 4.711 MEP 193 77.2*,121.1 83 13 6.030 13C-MEP 197 79.2*,123.7,151.1 79 13 6.027 MBP 221 77.1*,147.1,121.1 89 13 9.169 13C-MBP 225 79.2*,151.1,71.2,124.1 94 9 9.168 MBzP 255 77.2* 99 13 10.099 13C-MBzP 259 77.1*,79.2,107.1,105.1 99 13 10.098 MEHP 277 134.1*,77.1,127.2,121.1 99 5 13.332 13C-MEHP 281 137.1*,79.1,127.2,124.1 111 5 13.327 MEOHP 291 121.1*,77.1,143.2,113.1 121 9 9.488 13C-MEOHP 295 124.1*,79.2,143.2,113.1 101 9 9.486 MEHHP 293 121.1*,77.1,145.2,143.2 101 9 8.889 13C-MEHHP 297 124.1*,79.1,145.1 99 9 8.886 * Quantitative ion.

表1 7种邻苯二甲酸单酯及其内标的特征离子对、碎裂电压、碰撞能量和保留时间等质谱参数 Table 1 Precursor and product ion transitions,fragmentors,collision energies and retention times (RT) of the native and labeled seven phthalate metabolites

孕妇晨尿收集于马鞍山市妇幼保健院,采用聚丙烯尿杯收集,经转速 3500 r/min 离心10 min后,取上清液于聚丙烯尿管中,-80 ℃冰箱保存。实验时,取出冷冻储存的尿液,在室温条件下缓慢解冻,经转速 3500 r/min 离心10 min后,取上清尿液1 mL于玻璃试管中,分别加入200 μ L乙酸铵缓冲液(1 mol/L,pH 5.0)、50 Units β -葡萄糖醛酸酶和4 μ L内标混合工作液(1.0 mg/L),盖上玻璃盖,涡旋混匀后于37 ℃水浴振荡120 min。固相萃取小柱经3 mL甲醇和3 mL水活化后,将酶解处理后的尿样上样,再分别采用5%氨水溶液、纯甲醇和2%甲酸-40%甲醇-水溶液淋洗,最后采用2%甲酸-甲醇溶液洗脱。洗脱液经55 ℃水浴氮吹至微润后以0.2 mL体积比为1 ∶ 4的乙腈和水溶液定量复溶,供HPLC-MS/MS分析。

尿液中PAEs代谢产物以游离态和葡萄糖醛酸结合态两种形式存在,且部分代谢物的结合态所占比例较高,因此对样品进行去葡萄糖醛酸基的酶解处理十分必要。根据文献^[11],确定解离酶为 β -葡萄糖醛酸酶,酶解温度为37 ℃。文献报道的解离酶温育时间60～120 min、酶解环境pH 5.0～7.0、酶适宜用量各不相同。选取一份志愿者晨尿,分别将尿液酸化为pH 5.0、6.0、6.5和7.0,添加足够酶量后温育120 min,发现pH 5.0的环境中,酶解效果最佳(见图1)。确定尿液的适宜酸环境为pH 5.0后,在另一志愿者各等份尿液中各加入酶量0、5、50和100 Units分别温育60、90、120 min进行酶解,以MBP测定结果为指标。结果(见图2)发现,当酶添加量为50 Units并温育120 min时,与酶添加量为 100 Units的MBP测定结果无统计学差异(p= 0.070),综合考虑时间和成本,确定样品酶解处理的酶适宜用量为50 Units,温育时间为120 min。

图1

Fig. 1

图1 志愿者尿液在pH 5.0～7.0酸化处理后MBP、MEHP、 MEHHP和MEOHP的质量浓度( μ g/L) Fig.1 Mass concentrations of MBP,MEHP,MEHHP and MEOHP in volunteer urine after acidification at pH 5.0-7.0 levels

图2

Fig. 2

图2 志愿者尿液在不同的酶添加量和温育时间处理后 MBP的质量浓度 Fig.2 Mass concentrations of MBP in volunteer urine after processing with various amounts of glucuronidase enzyme and at various incubation times

通过比较Waters OASIS^® HLB柱(3 mL/60 mg)和MAX柱(3 mL/60 mg)的萃取效果,确定采用MAX柱进行固相萃取。这是由于MAX柱为混合阴离子交换柱,具有阴离子交换和反相吸附两种模式,因此本次实验采用了3个步骤进行淋洗。在上样后采用5%氨水(淋洗液A)过柱,促进酸性的邻苯二甲酸单酯化合物离子化,提高其在MAX柱的保留水平;再用纯甲醇(淋洗液B)淋洗减少有机杂质;2%甲酸-40%甲醇-水溶液(淋洗液C)淋洗去除酸性杂质且调节柱的酸碱度,便于洗脱;最后采用2%甲酸-甲醇溶液洗脱。通过比较不同使用量的洗脱剂(1～6 mL),发现洗脱剂≥3 mL时洗脱效果相似;考察淋洗液C中不同甲醇含量(0~50%)的淋洗效果，发现使用20%~40%甲醇的淋洗液C时，7种PAEs代谢物的回收率较好。为了更多地去除杂质，认为选择甲醇含量为40%的淋洗液C最合适(见图3);最后比较了淋洗液A、B和C不同配比的淋洗效果,发现采用1 mL淋洗液A、1.5 mL淋洗液B和1 mL淋洗液C的淋洗程序时回收率最佳(见图4)。

图3

Fig. 3

图3 采用不同甲醇含量(0～50% )的淋洗液淋洗后 7种PAEs代谢物的加标回收率 Fig.3 Recoveries of the seven phthalate metabolites after washing by the solutions of 0-50% methanol-2% acetic acid in water

图4

Fig. 4

图4 采用不同体积配比的5%氨水溶液、纯甲醇和2%甲酸- 40%甲醇-水溶液淋洗程序的7种PAEs的加标回收率 Fig.4 Recoveries of the seven phthalate metabolites after processing with various eluting procedures A. 5% ammonia in water; B. methanol; C. 2% formic acid-40% methanol in water.

为了避免塑料产品中塑化剂迁移污染,尿液处理材料均为玻璃制品,现洗现用。经重铬酸洗液过夜浸泡至少12 h,采用高纯水反复洗涤后,用LC-MS级甲醇润洗两遍,高温180 ℃烘1 h备用。每一批次样品处理的同时,采用LC-MS级水做两个平行空白样品,用于本底值扣除,以降低批次间的误差。

采用外标法定量检测时,7种PAEs代谢物的回收率极低(数据略);选择理化特征相似的¹³C-同位素作为内标物,不仅能够准确提供定性和定量信息,而且能有效避免样品基质影响,校正方法中出现的误差,显著提高检测方法的稳定性、准确度和精密度。

根据国内外研究发现,PAEs代谢物在苯基柱上的峰形及分离效果更好^[15,17],因此本实验室采用ZORBAX SB-Phenyl柱进行分离。PAEs代谢物是一类具有极性差异的羧基化合物,在流动相中加入一定量的乙酸,抑制羧基解离,可促进其在反相柱上的保留。采用含0.1%乙酸的乙腈-水体系作为流动相,通过梯度洗脱改变流动相的极性使混合物得到更好的分离。在8.0～17.0 min时,0.1%乙酸-乙腈溶液的浓度梯度增加缓慢,使MEOHP、MEHHP、MBP和MBzP 4种难分离代谢物的分离效果较好。用乙腈配制质量浓度为1.0 mg/L 的7种PAE代谢物单标准溶液,采用HPLC-MS/MS自动优化,获取灵敏度高、稳定性好的MRM检测离子对,优化碎裂电压和碰撞能量等质谱参数,结果见表1。