色谱  2015, Vol. 33 Issue (6): 647-651   PDF (881 KB)    
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成斌
谢一凡
胡优敏
刘慧中
钮因尧
陆阳
Chiralpak AD和Chiralcel OD-H手性固定相拆分3α-酰氧基-6β-乙酰氧基莨菪烷类化合物
成斌1, 谢一凡1, 胡优敏2, 刘慧中3, 钮因尧1 , 陆阳1    
1. 上海交通大学医学院药学系化学教研室, 上海 200025;
2. 上海交通大学医学院实验教学中心功能学 实验室, 上海 200025;
3. 上海交通大学医学院实验教学中心化学生物学实验室, 上海 200025
收稿日期：2015-01-27
基金项目：上海市卫生计生委科研课题(201440575);上海交通大学医学院科技基金项目(201406).
通讯作者：钮因尧, E-mail:niuyinyao@aliyun.com.
摘要：采用高效液相色谱法,以不同配比的正己烷-异丙醇为流动相,在正相色谱条件下,考察了6个3α-酰氧基-6β-乙酰氧基莨菪烷对映体在淀粉型手性固定相Chiralpak AD、纤维素型手性固定相Chiralcel OD-H上的分离情况,以建立该类化合物的手性拆分方法。结果表明,在Chiralpak AD手性柱上,对映体6实现完全分离,而对映体1完全不能分离;在Chiralcel OD-H柱上,对映体1、4、3分别实现完全分离、基线分离和基本分离,对映体6只能实现部分分离;对映体5在两种手性柱上都完全不能被分离。说明固定相手性空腔的结构对化合物的拆分结果影响很大。研究发现,C-3α 位取代基团的空间位阻效应主导手性固定相对对映体的选择性识别作用,而化合物与固定相之间的分子间作用力对手性拆分也产生重要影响。研究结果为其他莨菪烷类化合物的手性拆分提供了参考。
关键词： 高效液相色谱     对映体     莨菪烷     手性拆分    
Enantioseparation of 3α-acyloxy-6β-acetoxyltropane compounds with Chiralpak AD and Chiralcel OD-H chiral stationary phases
CHENG Bin1, XIE Yifan1, HU Youmin2, LIU Huizhong3, NIU Yinyao1 , LU Yang1    
1. Division of Chemistry, Department of Pharmacy, School of Medicine, Shanghai Jiao Tong University, Shanghai 200025, China;
2. Functional Training Laboratory, Experiment-teaching Center, School of Medicine, Shanghai Jiao Tong University, Shanghai 200025, China;
3. Chemicobiological Laboratory, Experiment-teaching Center, School of Medicine, Shanghai Jiao Tong University, Shanghai 200025, China
Received: 2015-01-27
Abstract: Six 3α-acyloxy-6β-acetoxyltropane compounds were enantioseparated by high performance liquid chromatography with amylose-based chiral stationary phase Chiralpak AD and cellulose-based chiral stationary phase Chiralcel OD-H in the normal phase mode, using various mixtures of n-hexane-isopropanol as mobile phases. The enantiomers 6 were completely separated on a Chiralpak AD column. While the enantiomers 1, 4 and 3 got complete, baseline and basic separation respectively on a Chiralcel OD-H column. However, the enantiomers 6 were partially separated on the Chiralcel OD-H column and enantiomers 1 could not be separated on the Chiralpak AD column. This indicated that the cave structure of chiral stationary phase exerted great effect on the resolutions. The enantiomers 5 could not be separated on both of the chiral stationary phases. The main possible mechanism of chiral resolution involves in spatial adaptability and molecular interactions between chiral stationary phases and compounds. The substituents in C-3α position of 3α-acyloxy-6β-acetoxyltropane compounds play an important role in spatial adaptability. And it was suggested that the steric hindrance effect of the substituent in C-3α position was the key factor of determining the selective recognition of chiral stationary phase to the enantiomers of 3α-acyloxy-6β-acetoxyltropane compounds. Besides, the molecular interaction, such as π-π interaction, also exerts great influence to the chiral resolution. This study provides a reference for the enantioseparation of many other tropane derivatives.
Key words: high performance liquid chromatography (HPLC)     enantiomer     tropane     chiral resolution    

毒蕈碱型胆碱能受体(muscarinic receptor,简称M受体)广泛分布于中枢及外周神经组织、心脏、平滑肌及腺体等,调节神经信号传递、心血管活动、平滑肌收缩及分泌腺功能等。M受体有M1～M5 5种亚型。其中,M3亚型主要位于平滑肌和腺体,是多种疾病的重要靶标。M3受体拮抗剂可用于临床治疗膀胱过度活动症等与平滑肌有关的疾病[1, 2],并已成为缓解慢性阻塞性肺病的首选药物[1, 3]。但是,亚型选择性(M3/M2)偏低的M3受体拮抗剂在临床应用中,因拮抗M2亚型受体会引起心动过速、矛盾性支气管收缩、黏液高分泌而产生较强的副作用[4, 5, 6, 7]。

由本课题组合成的系列外消旋3 α-酰氧基-6 β-乙酰氧基莨菪烷类化合物具有较好的M3受体拮抗活性及一定的亚型选择性(M3/M2)[8, 9]。这些化合物都具有(3S,6S)和(3R,6R)对映异构体。前期初步研究结果表明(3S,6S)-异构体的拮抗活性大多为(3R,6R)-异构体的100倍以上,且分子的绝对构型对亚型选择性(M3/M2)也有一定的影响[10]。与外消旋体相比,(3S,6S)-异构体更具有高效低毒的潜质和药物研发价值。因此,本课题组进一步设计合成了系列手性3 α-酰氧基-6 β-乙酰氧基莨菪烷用于生物学研究。为了准确评价该类化合物不同对映异构体的拮抗活性及亚型选择性(M3/M2),需要建立分析异构体光学纯度的方法,而该方法鲜见报道。

本文应用高效液相色谱(HPLC)法,分别利用淀粉型Chiralpak AD、纤维素型Chiralcel OD-H手性柱,尝试拆分3 α-酰氧基-6 β-乙酰氧基莨菪烷类化合物的6对对映异构体(结构见图1),探讨手性拆分机理,分析C-3 α 位取代基团的立体、静电性质对拆分结果的影响,为其他莨菪烷类化合物的拆分分离提供方法参考。

图1 3 α-酰氧基-6 β-乙酰氧基莨菪烷的对映异构体的结构 Fig.1 Structures of enantiomers of 3 α-acyloxy-6 β-acetoxyltropane compounds
1 实验部分
1.1 仪器和试剂

美国Agilent 1260高效液相色谱仪包括G1311C四元泵、G1329B自动进样器、G1316A柱温箱、G4212B二极管阵列检测器和OpenLAB CDS Chemstation色谱工作站;Chiralpak AD (250 mm×4.6 mm,10 μ m)色谱柱和Chiralcel OD-H(250 mm×4.6 mm,5 μ m)色谱柱购自大赛璐药物手性技术上海有限公司; 正己烷、异丙醇为HPLC级(美国TEDIA公司); 3 α-酰氧基-6 β-乙酰氧基莨菪烷类化合物由上海交通大学医学院化学教研室合成。

1.2 样品制备

于1 mL异丙醇中加入1 mg样品,超声溶解。取该溶液100 μ L,加入400 μ L正己烷,振荡摇匀。

1.3 色谱条件

色谱柱为Chiralpak AD、Chiralcel OD-H手性柱,流动相为不同配比的正己烷-异丙醇,流速0.8 mL/min,检测波长为210 ～ 250 nm范围内化合物的最大吸收波长,柱温30 ℃,进样体积5.0 μ L。

2 结果与讨论
2.1 Chiralpak AD手性柱对系列化合物的拆分

在正相色谱条件下,选择不同的流动相以及各种配比拆分6个目标物,通过比较分离结果,获得最优的色谱分离条件。以正己烷-异丙醇为流动相,6对对映异构体在Chiralpak AD手性柱上的拆分结果见表1,色谱图见图2。可以看出，Chiralpak AD手性柱对对映体6的选择性识别能力最强(选择性因子 α =1.21),对映体6实现完全分离(Rs=3.31);手性柱对对映体2、3、4的选择性识别能力较低( α =1.03,1.05,1.05),3对对映体仅实现部分分离(Rs=0.55,0.72,0.90);对对映体1、5没有选择性( α 均为1.00),两对对映体完全没有被分离(Rs均为0)。

表1 α-酰氧基-6 β-乙酰氧基莨菪烷系列化合物在Chiralpak AD手性柱上的拆分 Table 1 Enantioseparation of 3 α-acyloxy-6 β-acetoxyltropane compounds on a Chiralpak AD column

图2 正相色谱条件下6个3 α-酰氧基-6 β-乙酰氧基莨菪烷化合物在Chiralpak AD柱上拆分的色谱图 Fig.2 Chromatograms of enantioseparation of six 3 α-acyloxy-6 β-acetoxyltropane compounds on a Chiralpak AD column under normal phase conditionsa-f: compounds 1-6 in Fig. 1.
Mobile phases: for enantiomers 1-5,n-hexane-isopropanol (95 ∶ 5,v/v); for enantiomers 6,n-hexane-isopropanol (80 ∶ 20,v/v).
Flow rate: 0.8 mL/min. Column temperature: 30 ℃.
2.2 Chiralcel OD-H手性柱对系列化合物的拆分

在正相色谱条件下,通过条件优化实验，获得Chiralcel OD-H手性柱拆分6对对映体的最优分离条件。以正己烷-异丙醇为流动相,6对对映异构体在Chiralcel OD-H手性柱上的拆分结果见表2,色谱图见图3。可以看出，Chiralcel OD-H手性柱对对映体1的选择性最大( α =1.10),对映体实现完全分离(Rs=2.32);与淀粉型Chiralpak AD手性柱相比,纤维素型Chiralcel OD-H手性柱对对映体2、3、4的选择性增强( α =1.04,1.07,1.09);对映体2的分离度明显增大(Rs=0.80),而对映体3、4分别实现基本分离(1 ＜ Rs=1.46 ＜ 1.5)和基线分离(Rs=1.54);但是对对映体6的选择性却降低( α =1.05),对映体仅实现部分分离(Rs=1.00);手性柱对对映体5没有选择性( α =1.00),对映体完全没有被分离(Rs=0)。

表2 3 α-酰氧基-6 β-乙酰氧基莨菪烷系列化合物在Chiralcel OD-H手性柱上的拆分 Table 2 Enantioseparation of 3 α-acyloxy-6 β-acetoxyltropane compounds on a Chiralcel OD-H column

图3 6对3 α-酰氧基-6 β-乙酰氧基莨菪烷对映体在正相条件下Chiralcel OD-H柱上拆分的色谱图 Fig.3 Chromatograms of enantioseparation of six 3 α-acyloxy-6 β-acetoxyltropane compounds on a Chiralcel OD-H column under normal phase conditionsa-f: compounds 1-6.
Mobile phase for enantiomers 1: n-hexane-isopropanol (90 ∶ 10,v/v); for enantiomers 2-6: n-hexane-isopropanol (95 ∶ 5,v/v). Flow rate: 0.8 mL/min. Column temperature: 30 ℃.
2.3 两种手性柱对3 α-酰氧基-6 β-乙酰氧基莨菪烷的拆分机理和结果分析

Chiralpak AD、Chiralcel OD-H柱的手性固定相分别是涂敷在10 μ m、5 μ m厚硅胶表面的直链淀粉-三(3,5-二甲苯基氨基苯甲酸酯)和纤维素-三(3,5-二甲苯基氨基苯甲酸酯)[11](结构见图4)。多糖类手性固定相的拆分机制尚未被完全阐明。一般认为手性固定相内部存在手性空腔,化合物全部或部分进入空腔,与固定相之间产生氢键作用,同时发生偶极-偶极、 π - π 等相互作用。具有一定空间位阻的取代基能使一对对映体与固定相的手性空腔产生一定的空间适应性差异,有助于形成具有不同稳定性的非对映体复合物,从而被先后洗脱分离[12, 13]。

图4 (a)Chiralpak AD和(b)Chiralcel OD-H手性固定相的结构 Fig.4 Structures of chiral stationary phases of (a) Chiralpak AD and (b) Chiralcel OD-H

本文中莨菪烷类化合物的C-3 α 位酰氧基的羰基O作为给电子体可能与固定相R基团中的NH形成氢键,同时,C-3 α 位上的五、六元环和固定相的芳香环也可能存在 π - π 作用。但是,由于C-3 α 位取代基团的静电、立体性质不同,同一手性柱对于3 α-酰氧基-6 β-乙酰氧基莨菪烷系列各化合物的拆分效果存在明显差异。

对映体4的C-3 α 位取代基团3,3-二苯基-丙酰氧基,其体积比对映体2、3的苯丙酰氧基、对氯苯乙酰氧基的体积大。适当增加化合物的空间位阻,有利于扩大一对对映体与固定相之间的空间适应性差异,提高手性柱对旋光异构体的识别能力,所以对映体4在两种手性柱上的拆分效果都优于对映体2、3。对映体3与2相比,C-3 α 位取代基的苯环上多了一个氯原子,通过p- π 共轭,适当增强化合物与手性固定相之间的 π - π 作用,有利于增加一对对映体保留时间之间的差异,使其更容易被分离。在两种手性柱上,对映体3的分离度比对映体2略高。对映体6与4相比,在C-3 α 位通过环化固定两个苯环的相对位置,进一步增加了空间位阻,提高了Chiralpak AD手性柱对对映体6的选择性识别能力,从而实现了对映体的完全分离。对映体5与4相比,C-3 α 位的取代基团(3,3,3-三苯基-丙酰氧基)多了一个苯环,在增加空间体积的同时,可能大大增强了化合物与固定相之间的 π - π 相互作用,延长化合物在两种手性柱中的保留时间(对映体5在两种手性柱中的保留时间最长),同时显著降低了对映体与固定相之间的空间适应性差异,使得两种手性柱对对映体5无选择性识别能力,对映体完全不能被拆分。可见 π - π 相互作用在对映体的拆分中也发挥着重要作用。

淀粉型Chiralpak AD和纤维素型Chiralcel OD-H两种手性柱的固定相虽然都属于多糖,且分子式相同,但淀粉型固定相以 α-1,4糖苷键连接形成螺旋结构,而纤维素型固定相却通过 β-1,4糖苷键形成线型结构,它们各自形成的手性空腔的空间结构不同,与同一化合物的一对对映异构体之间的空间适应性差异不同,使得化合物在两种手性柱上的拆分效果完全不同。例如,在Chiralpak AD柱上,对映体6实现完全分离,对映体1完全不能分离。但在Chiralcel OD-H柱上,对映体6只能实现部分分离,而对映体1却实现完全分离。除对映体5、6以外,Chiralcel OD-H柱对化合物的拆分能力都强于Chiralpak AD柱,表明总体上Chiralcel OD-H柱对3 α-酰氧基-6 β-乙酰氧基莨菪烷系列化合物的拆分效果更好。此外,由于两手性柱填料的粒径不同(Chiralpak AD,10 μ m;Chiralcel OD-H,5 μ m),柱效相差较大,对拆分效果也会产生一定的影响。

流动相中的极性成分异丙醇也能与固定相形成氢键,抑制化合物-固定相复合物的形成,降低Chiralpak AD、Chiralcel OD-H柱的手性识别能力。因此,减小流动相中异丙醇的比例,能增强两种手性柱对对映异构体的手性识别能力,延长化合物在柱中的保留时间,提高对映体的分离度[14]。

3 结论

本文考察了6个外消旋体3 α-酰氧基-6 β-乙酰氧基莨菪烷在Chiralpak AD、Chiralcel OD-H手性柱上的拆分情况。在Chiralpak AD手性柱上，对映体6实现完全分离，而对映体1完全不能分离；在Chiralcel OD-H柱上，对映体1、4、3分别实现完全分离、基线分离和基本分离,对映体6只能实现部分分离；对映体5在两种手性柱上都完全不能被分离。说明固定相手性空腔的结构对化合物的拆分结果影响很大。对映体5在两种手性柱上都完全不能被分离。拆分结果表明,C-3 α 位取代基团的空间位阻效应是决定对映体与手性空腔空间适应性差异的关键因素,它主导手性固定相选择性识别对映体的能力强弱,但是化合物与固定相之间的分子间作用力在对映体的拆分中也发挥重要作用。本研究方法为其他莨菪烷类化合物的手性拆分提供了参考。

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