高效液相色谱(HPLC)及其联用技术是目前最常用的分离和检测手段,已经广泛运用于食品分析、环境监测、化学化工、药物研发及检测等领域[1,2]。作为色谱分离的核心,固定相的发展直接影响着色谱技术的发展和应用。新型固定相的研发一直是HPLC的重要课题和前沿方向[3,4,5]。随着分离分析样品复杂性和多样性的不断提高,满足各种分析需要的色谱固定相应运而生。其中,手性固定相和适于极性物质分离的固定相成为两大研究热点。一方面,手性药物对映体药效和毒性存在显著差异,手性药物对映体的检测、分离、制备和纯化成为亟待解决的问题,从而促使各种刷型、冠醚类、环糊精类、蛋白质类、抗生素类、多糖类手性固定相[5,6,7,8,9]大量涌现并迅速发展。另一方面,为克服常用烷基反相固定相(如C18固定相)的保留机理单一、对极性特别是碱性化合物分离能力差的缺陷,许多色谱工作者一直致力于开发各种适于分离极性化合物包括碱性物质的固定相。其中,人们十分关注的亲水相互作用色谱(HILIC)固定相是解决这类问题的有效途径之一,HILIC固定相在极性药物、蛋白质组学、代谢组学、天然产物等方面显示出广阔的应用前景[10,11,12,13,14]。中科院大连化物所的梁鑫淼课题组在这方面取得了一系列先进的研究成果,如通过无铜催化的“巯基-烯基”点击化学方法研制了半胱氨酸型两性离子HILIC固定相[13]和以谷胱甘肽为配体的新型亲水/阳离子交换混合模式固定相[14];与多数商品化HILIC固定相相比,上述两种固定相具有优越的亲水性,在多肽等极性物质的分离中具有很好的分离选择性。另外,近年来李来生等[15,16]采用天然植物药用成分槲皮素、厚朴酚和靛红等作为配基制备了多作用位点的键合相,由于键合相疏水性适中且作用位点丰富,可成功应用于极性化合物包括碱性物质的快速、简便、有效分离。而且该类固定相的制备方法相对简单,原料来源广泛，成本较低，绿色无毒,适合批量化生产甚至作为工业色谱的绿色富集材料。
丁香酚(eugenol,4-烯丙基-2-甲氧基苯酚)是桃金娘科植物丁香中的一种天然活性成分,为无色或苍黄色液态酚类[17];其原料丰富、可再生。研究表明丁香酚具有解热镇痛、抑菌、抗炎、抗氧化、抗肿瘤、麻醉、增强记忆、驱蚊避虫等广泛的药理作用[18]。目前丁香酚已广泛应用于医药、化妆品和食用香料等诸多领域,但还未见丁香酚作为色谱分离材料的报道。
本文制备了丁香酚键合硅胶液相色谱固定相(EGSP),并填装成EGSP柱。以不同类型的芳香族化合物为溶质探针,C18柱和苯基柱为参照,侧重评价EGSP的基本色谱性能,并探讨相关的保留机理,以发掘该固定相的应用优势。
Agilent 1260高效液相色谱系统(配有四元泵、二极管阵列检测器、柱温箱、OpenLAB CDS ChemStation软件和手动进样器,美国安捷伦科技有限公司); Vario ELⅢ型元素分析仪(德国Elementar公司); IR Affinity-1傅里叶变换红外光谱仪(日本岛津公司); DTG-60差热-热重同时分析装置(日本岛津公司); RPL-ZD10装柱机(大连日普利科技有限公司);不锈钢色谱柱管(150 mm×4.6 mm,天津市倍思乐色谱技术开发中心);用于对照研究的C18色谱柱(ZORBAX Eclipse XDB-C18,150 mm×4.6 mm,5 μ m)和苯基色谱柱(ZORBAX Eclipse XDB-Phenyl,250 mm×4.6 mm,5 μ m),购于美国安捷伦科技有限公司。
丁香酚(纯度≥99% ,四川西亚化工股份有限公司),球形硅胶(粒径5 μ m,孔径10.8 nm,比表面积为236 m2/g,中国青岛美高化工有限公司),γ -[(2,3)-环氧丙氧]丙基三甲氧基硅烷(KH-560)(纯度≥98% ,武汉市华昌应用技术研究所),乙腈(色谱纯,西陇化工股份有限公司),复方水杨酸搽剂(上海运佳黄浦制药有限公司),其他试剂均为分析纯。实验用水为二次蒸馏水。
EGSP的制备路线见图1。(1)取16 g球形硅胶,浸泡于3 mol/L 盐酸中回流24 h,用二次蒸馏水洗至中性,然后用丙酮洗涤,在160 ℃下干燥8 h,得活化硅胶,保存于干燥器中备用。(2)取5.0 g经活化的干燥硅胶,加入80 mL金属钠除水新蒸的无水甲苯中,搅拌下加入4.0 mL KH-560和3滴三乙胺。在N2保护下加热回流12 h,冷却,用甲苯抽提24 h,依次用丙酮、甲醇和丙酮洗涤,70 ℃下真空干燥至恒重,得偶联剂键合硅胶(GBS)。(3)取2.0 mL丁香酚加入80 mL无水甲苯中,搅拌下加入4.5 g偶联剂键合硅胶和2滴高氯酸,在N2保护下加热回流24 h,冷却,用甲苯抽提24 h,依次用丙酮、甲醇和丙酮洗涤,70 ℃下真空干燥至恒重,得EGSP。
通过元素分析、热重分析和红外光谱分析表征GBS和EGSP的结构。
采用匀浆法装柱,以异丙醇为匀浆剂,用装柱机将EGSP填入不锈钢色谱柱管(150 mm×4.6 mm)中,刚开始维持压力在40～50 MPa,当流出液约为100 mL时将压力调至35 MPa保持40 min。新EGSP柱用乙腈反复冲洗后再接检测器,待基线平稳后进样分析。流动相使用前先过滤和超声脱气。溶质探针用流动相配制成质量浓度为50～250 mg/L 的溶液,过滤,一般进样5 μ L;以溶剂峰的保留时间为死时间,柱温为32 ℃,流速为0.8 mL/min,至少平行测定2次。
EGSP的红外光谱如图2所示,3520 cm-1左右处的吸收峰是硅胶表面游离硅羟基和偶联剂链羟基伸缩振动峰信号。2953.02、2893.02 cm-1两峰为C-H伸缩振动吸收峰,说明硅胶表面含有机物。1625.99 cm-1附近的峰为丁香酚中芳环和烯基的C=C伸缩振动;1105.21 cm-1是Si-O和C-O的伸缩振动重叠吸收带,804.32 cm-1与Si-O的伸缩振动和苯环上C-H的面外弯曲振动有关。以上信息表明硅胶表面已键合上丁香酚配体。
3次重复实验产物的元素分析结果见表1,根据元素分析碳含量计算出丁香酚配体的键合量为0.28 mmol/g。热重分析测得EGSP比GBS多失重4.86%(30～720 ℃,10 ℃/min,见图3),折算出键合量为0.30 mmol/g,这与元素分析计算出的键合量基本相符。当温度高于300 ℃时EGSP才开始失重,说明丁香酚键合在硅胶表面后具有较高的热稳定性。
以萘为溶质探针,乙腈-水(35 ∶ 65,v/v,0.8 mL/min,32 ℃)为流动相,萘在EGSP中的保留时间为11.470 min,测得EGSP的柱效为 24707 N/m。而乙腈-水的比例为50 ∶ 50(v/v)、其他条件同上时,萘在商品化C18柱和苯基柱的保留时间分别为15.207 min和12.852 min,相应测得的理论塔板数分别为 88887 N/m和 97884 N/m。EGSP的柱效比作为参照的商品柱低,主要原因为(1)我们采用的是国产的球形硅胶,粒径和孔径分布较宽,色谱性能方面不如商品柱的特制超高纯度进口硅胶。(2)EGSP柱未经封尾处理,两商品柱均采用了双封端处理。(3)商品柱厂家采用的是先进和专业的装柱设备,我们采用国产简易装柱机填装。柱的填料和填装技术比不上专业公司。
采用乙腈-水和乙腈-0.02 mol/L KH2PO4 (35 ∶ 65,v/v,pH=3.0)反复交替冲洗新柱7天,萘的保留时间变化很小,柱效变化不大,说明EGSP柱键合层稳定,色谱保留重现性好;同时发现该柱在磷酸盐流动相中长时间使用也不易生菌,能保持良好的柱渗透性和稳定的色谱性能,这可能与硅胶表面的丁香酚具有抑菌作用有关。另外,经长时间使用的固定相填料能使KMnO4溶液紫色消退,并有少量棕褐色的MnO2沉淀出现,说明长期使用的固定相中的烯基还能很好地保留。
以苯、甲苯、乙基苯为溶质探针,以C18柱和苯基柱为参比,考察了EGSP的疏水性。结果表明,在乙腈-水(35 ∶ 65,v/v)流动相中,烷基苯保留因子的对数值(lg k)与亚甲基数(n)之间呈现良好的线性关系,符合碳数规律。EGSP线性斜率p=0.1335,线性相关系数r2=0.9998,疏水选择性因子 α 2,1=1.35;C18柱在相同条件下p=0.3053,r2=0.9998,α 2,1=1.99;苯基柱在相同条件下p=0.2313,r2=0.9979,α 2,1=1.78。可见EGSP具有典型的反相色谱特征,但其疏水性比C18柱和苯基柱弱,这与配体本身含有极性基团和键合量较低有关。
实验考察了5种中性化合物在EGSP柱上lgk随流动相中乙腈含量(φ)的变化趋势,结果表明,溶质的保留值随着乙腈含量的增加而减小,lgk与φ之间呈线性关系,出峰顺序与C18柱和苯基柱所得结果一致,进一步说明EGSP是一种反相色谱分离材料。EGSP在分离中性化合物时主要基于疏水作用,但其他的作用力(如 π - π 电荷转移、氢键和偶极-偶极作用等)对分离也有贡献。如图4所示,在与EGSP柱相同的色谱条件下,5种中性化合物在C18柱和苯基柱上完全洗脱需要很长的时间,在80 min内,乙基苯均未能从两固定相中洗脱出来。当流动相中乙腈比例由23%提高至35%时,C18柱才能在63 min内实现5种化合物的等度洗脱。而在苯基柱上,当乙腈比例提高至35%时,将5种化合物完全洗脱需要40 min,且无论乙腈比例是23%还是35% ,苯甲醛和水杨醛两者均合为一峰,难以分开。综上可见,EGSP是一种良好的反相色谱固定相,相对较弱的疏水性以及含有芳环和烯基等作用位点使EGSP在流动相中乙腈含量较低的条件下能够实现上述中性化合物的良好快速分离。
以6种芳香胺类化合物为溶质探针,考察了EGSP对碱性样品的分离。结果表明,在较低乙腈含量和较短时间(10 min)内,6种溶质能在EGSP上实现良好分离(见图5)。在相同条件下,C18柱和苯基柱虽然也能实现良好分离,但所用时间较长(分别为38 min和36 min)。疏水作用是溶质在C18柱上的唯一作用机制,溶质在C18柱上的保留时间依照其疏水性大小分别为:烟酰胺＜苯胺＜对硝基苯胺＜1-萘胺＜ N,N-二甲基苯胺＜二苯胺。在苯基柱中,虽然溶质与固定相还存在 π - π 电荷转移作用,但疏水作用占支配地位,溶质的洗脱顺序与C18柱一致。在EGSP柱中疏水作用仍为主导作用,使得大部分溶质的洗脱顺序与C18柱一致,但也存在例外,例如:N,N-二甲基苯胺的疏水性明显强于1-萘胺,但N,N-二甲基苯胺在EGSP上的保留反而弱于1-萘胺,显然带有较大 π 电子体系和伯氨基的1-萘胺与EGSP中丁香酚配体上的芳环、烯基和甲氧基发生了较强的 π - π 电荷转移、氢键和偶极-偶极作用,这些作用的影响强于两者疏水性的差异,使得在EGSP上1-萘胺的保留强于N,N-二甲基苯胺。
由图6可见,上述6种碱性物质在EGSP上的保留因子对数值(lgk)随流动相中乙腈含量增加而呈线性递减,并未出现“U”形曲线[19];而且色谱峰形较对称(见图5)。说明丁香酚的多作用力更易与芳香胺作用,从而降低了碱性溶质与残存硅羟基的作用几率,在一定程度上克服了拖尾现象。尽管EGSP没有进行封尾处理,采用简单的乙腈-水流动相,也能实现上述含氮碱性化合物的快速有效分离。
如图7所示,6种酚类化合物在EGSP上实现了快速有效分离。该类溶质在EGSP的出峰顺序与C18和苯基柱一致,对苯二酚和间苯二酚在上述3种固定相中的保留均较小;而2-甲氧酚和邻甲酚由于甲氧基和甲基的取代,溶质的疏水作用增强,保留值增大; β-萘酚和 α-萘酚中萘环疏水性大于苯环使得其保留进一步增强,从而最后被洗脱。说明EGSP对这6种溶质的分离主要还是基于疏水相互作用。在相同的色谱条件下,相对较弱的疏水性使得EGSP有效分离6种溶质所需的时间最短(10 min),C18柱次之(14 min),苯基柱最长(17.5 min)。说明溶质与苯基固定相除发生疏水作用外,还发生了较强的 π - π 电荷转移作用;同时苯基柱柱长250 mm(EGSP和C18柱长均为150 mm)也是导致溶质保留时间较长的原因。实际上，在前文其他溶质的分离中，此因素也有一定影响，但因不是主要影响因素，所以未单独指出，此处一并补充说明。
复方水杨酸搽剂是一种常见的治疗手癣、足癣、体癣的皮肤科非处方药,其主要成分包括水杨酸、间苯二酚、苯酚、水杨酸甲酯和甘油。将复方水杨酸搽剂用乙腈稀释、过滤,可直接测定前4种组分。如图8所示,4种成分在EGSP柱上的洗脱时间为:间苯二酚＜苯酚＜水杨酸甲酯＜水杨酸。而相同条件下,在C18柱和苯基柱上苯酚和水杨酸合为一峰,水杨酸甲酯由于羧基被酯化,疏水性增强,在C18柱和苯基柱上的保留比水杨酸强。与C18柱相比,由于缺少甲氧基等氢键作用基团,苯基柱对上述溶质的分离并未显示出明显的区别或优越性。而EGSP能与水杨酸上的羧基产生较强的氢键和偶极作用, 这种作用强过疏水作用的影响,以致EGSP对水杨酸的保留强于水杨酸甲酯,这与文献[15]的报道类似。协同作用的结果使4种成分在EGSP柱上实现了良好分离。可见,EGSP在对复方水杨酸搽剂等酸性实际样品分离中显示出独特和优秀的色谱分离选择性。
本文制备了EGSP固定相,EGSP对溶质的分离主要基于疏水相互作用,同时由于丁香酚配体中含有苯环、烯基和甲氧基等多种作用位点,能与溶质发生 π - π 电荷转移作用、氢键作用以及偶极-偶极作用。与C18柱和苯基柱相比,适当的疏水性和多种作用力的协同作用使得EGSP在对极性芳香族化合物的有效、简便和快速分离分析中显示出明显的优势和独特的分离选择性。EGSP柱能在一定程度上弥补传统的C18柱和苯基柱的不足。该固定相制备方法简单,配体资源丰富、廉价和无毒,也可作为工业色谱的绿色富集材料。
2015, Vol. 33 Issue (5): 461-467
PDF (1081 KB)
2015, Vol. 33 Issue (5): 461-467
PDF (1081 KB)