α -氰基-4-羟基肉桂酸(CCA)、三氟乙酸(TFA)、 Bio-Rad Protein Assay Dye Reagent、Marker等均购自Sigma公司,十二烷基硫酸钠(sodium dodecylsulfate,SDS)、甘氨酸、丙烯酰胺、N,N-亚甲基双丙烯酰胺为Amresco公司产品,乙腈为国产色谱纯试剂,其他为国产分析纯试剂。

Waters Alliance 2695高效液相色谱仪,配Waters 2489紫外检测器(美国Waters公司)(用于多肽的分离纯化); Ultraflex型基质辅助激光解吸飞行时间质谱仪(德国Bruker公司) (用于粗毒的鉴定); microTOFQ-II电喷雾四极杆飞行时间串联质谱仪(Bruker公司)(用于蛋白质的鉴定); Ultimate 3000液相色谱仪(戴安公司),Bio-Rad Protein II垂直平板电泳系统,Biophotometer plus核酸蛋白测定仪(德国Eppendorf公司)。

家福捕鸟蛛采集于广西宁明县的山区,并带回湖南在室内人工饲养。成年的家福捕鸟蛛饲养于用网状材料覆盖的塑料桶中,每日给水,每个星期喂以猪肝(切成约1～2 cm³的块状)、蟑螂或面包虫。采用电刺激的方法每2个星期采集毒液一次^[6]。采集的毒液为无色透明的液体。毒液蛋白质含量的测定采用改良后的考马斯亮蓝染色法进行。 实验除了将G-250染液换成Bio-Rad Protein Assay Dye Reagent外,其他操作过程与考马斯亮蓝染色法完全相同。

粗毒用去离子水溶解至质量浓度为10 g/L,于4 ℃以 14 000 r/min 离心30 min,然后用0.22 μ m微孔过滤器过滤;毒液在反相HPLC系统上进行分离纯化;上样体积为100 μ L;分离柱是C18柱(Phenomenex 100 ,250 mm×4.6 mm,5 μ m);流动相:A为0.1% TFA水溶液,B为含0.1% TFA的乙腈;线性梯度洗脱^[11]: 0～50 min,0～50%B;流速为1.0 mL/min,在215 nm波长下检测并收集洗脱峰,每分钟收集1管。洗脱峰经冷冻干燥后用30 μ L含0.1% TFA的50%乙腈水溶液溶解,用于质谱鉴定。

质谱分析在MALDI-TOF质谱仪上进行。用含0.1%TFA的50%乙腈水溶液溶解CCA基质至质量浓度为10 g/L,取0.5 μ L样品与1.0 μ L 10 g/L 的CCA基质液混合,然后取0.5 μ L混合液在质谱仪的点样盘上点样,室温下自然风干后测定样品的相对分子质量。采用线性模式,离子源加速电压为20 kV,N₂激光波长337 nm,脉冲宽度3 ns,离子延迟提取150 ns,真空度5.33×10^-5 Pa (4×10^-7 Torr),阳离子模式。

粗毒用去离子水溶解至质量浓度为10 g/L 的溶液,于4 ℃以 14 000 r/min 离心30 min,然后用0.22 μ m微孔过滤器过滤。溶液采用SDS-PAGE的方法(15%的分离胶和5%的浓缩胶)进行粗毒蛋白质相对分子质量的测定。电泳完成后用考马斯亮蓝G-250进行染色。

按照1.3节和1.4节方法进行色谱分离和质谱鉴定。质谱采集和数据分析分别用Bruker Daltonics Flexcontrol软件和Flexanalysis软件,将所得到的数据以洗脱时间为X轴,以质荷比为Y轴,以质谱峰强度为Z轴制作Landscape,直观展示家福捕鸟蛛粗毒中多肽的疏水性(与洗脱时间有关)、相对分子质量以及丰度的分布。

粗毒胶内蛋白质原位酶解参考文献^[16]的方法进行。

粗毒的质谱分析及蛋白质的搜寻鉴定参考文献^[16]的方法进行。

本实验采用电刺激方法采集家福捕鸟蛛毒液,毒液为无色透明的液体,易溶于水。每只家福捕鸟蛛每次约能射毒液5～20 μ L。家福捕鸟蛛新鲜毒液重量为1.07 mg/ μ L,毒液冻干后的重量为51.3 μ g/ μ L,新鲜毒液蛋白质含量为9.15 μ g/ μ L,粗毒对美洲蜚蠊的半致死剂量(LD₅₀)为85.62 μ g/g。

典型的家福捕鸟蛛粗毒的反相高效液相色谱图见图1A。从图1A中可以看出,家福捕鸟蛛粗毒的成分复杂,在215 nm下可以检测到40多个色谱峰,大部分色谱峰的保留时间处于5～15 min和25～40 min两个时间区域,对应的乙腈体积分数分别为5% ～15%和25% ～40% 。保留时间为5～15 min区域的色谱峰在相对分子质量设定为 1 000～10 000 的MALDI-TOF-MS鉴定中没有显示任何质谱峰,表明这一区域的洗脱峰主要是一些低相对分子质量的有机化合物和盐类。保留时间为25～40 min区域的色谱峰经MALDI-TOF-MS鉴定为多肽分子,此区域多肽分子是家福捕鸟蛛粗毒含量最丰富的成分,也是后续开展家福捕鸟蛛毒素结构与功能研究的主要部分。

为了对家福捕鸟蛛粗毒中的蛋白质组分有个初步了解,采用SDS-PGAE对粗毒中蛋白质相对分子质量的分布进行了测定,结果表明,除了相对分子质量在 10 000 以下的多肽外,电泳图谱显示粗毒在50、72和90 kD附近有3条明显的条带(图1B)。

众所周知,蜘蛛粗毒主要由蛋白质类、多肽类以及低相对分子质量的有机化合物和盐类组成,其中含量最多的是多肽类化合物^[6]。质谱技术特别是MALDI-TOF-MS技术的发展为蜘蛛毒素的鉴定提供了强有力的技术支持^[17]。因此,我们通过MALDI-TOF-MS技术对家福捕鸟蛛粗毒进行鉴定。实验结果表明:在线性模式下,相对分子质量设定为 1 000～10 000 范围内,粗毒通过MALDI-TOF-MS鉴定到大约20多个质谱峰。质谱峰的相对分子质量分布于 2 000～8 000 之间,大部分处于 3 000～4 500 之间(图1C)。

图1

Fig. 1

图1 家福捕鸟蛛粗毒的分离和质谱鉴定 Fig.1 Separation and mass spectrometric identification of the S. jiafu venomA. RP-HPLC of the S. jiafu venom; B. SDS-PAGE of the S. jiafu venom; a. markers; b and c. venom; 1-6. MS identification bands. C. MALDI-TOF-MS of the S. jiafu venom.

由于蜘蛛粗毒的复杂性及技术的局限性,蜘蛛毒素的系统性研究一直是瓶颈。MALDI-TOF-MS技术及液相色谱-质谱联用(LC-MS)技术的发展为蜘蛛毒素的系统分析提供了可能^[18],Escoubas等^[19]采用这种技术从澳大利亚漏斗网蛛两种蜘蛛粗毒中分别鉴定到了633个和 1 018 个多肽分子。这是第一次在蜘蛛粗毒中鉴定到如此多的多肽分子,远高于以前普遍认为的每种蜘蛛毒腺含有50～100个多肽分子^{[20, 21]}。而且研究还发现漏斗网蛛粗毒中的多肽的相对分子质量呈双峰分布,主要分布于 3 000～5 000之间,其次分布于 6 500～8 500 范围内。这与虎纹捕鸟蛛^[22]、海南捕鸟蛛^[23]、敬钊缨毛蛛^[24]的研究结果类似。

采用MALDI-TOF-MS结合HPLC分离技术,我们对家福捕鸟蛛粗毒多肽与蛋白质的多样性进行了研究。大部分的色谱峰都含有一定相对分子质量的多肽类物质,个别峰甚至含有多达十几个不同相对分子质量的多肽,说明在蜘蛛毒素中存在相对分子质量不同但疏水性特别接近的组分。本实验一共鉴定到238个多肽分子,显示了粗毒多肽分子的多样性(见图2A)。研究还发现家福捕鸟蛛粗毒中多肽的相对分子质量也呈现双峰分布,但其相对分子质量的分布特征与已报道的其他蜘蛛不同。其多肽的相对分子质量分布为:62.5%的多肽毒素分布在 3 000～4 500 之间,33.2%的多肽毒素分布在 1 000～3 000 之间,在 6 500～8 500 范围内很少(见图2B)。这说明家福捕鸟蛛毒素和其他蜘蛛毒素在进化上采用了不同的方式。因此,进一步研究家福捕鸟蛛与其他蜘蛛毒素中多肽的分布差异,将有助于了解蜘蛛毒素的进化机制。

图2

Fig. 2

图2 家福捕鸟蛛粗毒的分子多样性 Fig.2 Molecular diversity of the S. jiafu venomA. Peptide molecular mass distribution of the S. jiafu venom by RP-HPLC and MALDI-TOF-MS analysis. B. Histograms show the abundance of peptide toxins in the venom,sorted into 500 Da molecular mass classes. The overlaid curve shows the cumulative total of peptide masses identified from LC-MALDI MS analyses. C. 3D landscape of the S. jiafu venom.

通过整合实验数据,以流分(fraction number)为X轴,以质荷比为Y轴,以质谱峰强度为Z轴绘制家福捕鸟蛛粗毒多肽分子的三维直观图(图2C)。该直观图对家福捕鸟蛛粗毒提供了详细的注释。通过直观图可以直观地看到每一个多肽分子的保留时间、相对分子质量以及质谱峰强度,而且在反相高效液相色谱分离中没有完全分开的多肽分子通过三维直观图中相对分子质量的差异能够区分开。从图2C中可以发现多肽分子主要处于相对分子质量在 3 000～4 500、保留时间在15～45 min范围内。

虽然在整体水平上我们对蜘蛛粗毒的相关知识有了初步的了解,但在很大程度上我们对其多肽分子多样性和丰度的了解相当有限,因此低估了其分子多样性,主要原因如下^[19]: 1)蜘蛛粗毒是一个由很多结构和活性不同的成分组成的复杂混合物,除了占大部分的多肽和蛋白质外,蜘蛛毒素中含有很多盐类和小分子化合物,这些盐类和小分子化合物大多数很容易离子化,这些离子化的物质干扰多肽的离子化过程,使得实验结果不准确;2)蜘蛛粗毒中经常会存在一些相对分子质量和疏水性特别接近的多肽分子,这些多肽分子在RP-HPLC分离和MALDI-TOF-MS鉴定时很难区分;3)蜘蛛粗毒中虽然多肽分子数量成百上千,但是除了数量有限的多肽分子含量较高,是高丰度多肽分子外,大部分多肽分子在粗毒中含量很低,现有的质谱技术很难将其区分和鉴定。

为了使家福捕鸟蛛粗毒中分离的蛋白质能够被有效地鉴定,粗毒经SDS-PAGE分离后切割为6个条带(图1B)。条带被取下,经脱色、还原烷基化后采用胰蛋白酶酶解。酶解结束后,用含有不同体积分数的乙腈水溶液对条带进行萃取,合并萃取液,冻干,保存于冰箱。质谱分析时,每一条带酶解后的多肽混合物先通过Dionex的反相LC分离后在线进入Bruker公司的microTOFQ II质谱分析系统进行质谱分析。获得的数据经Bruker公司的Data Analysis 4.0软件分析后以mgf文件输出。将得到的mgf文件采用Mascot软件中的串联质谱数据搜索功能(MS/MS Ions Search)搜索,由于没有专门的蜘蛛毒素蛋白质数据库,因此本文采集到的MS/MS数据在进行数据库搜寻时所选数据库范围为SwissProt(蛋白序列数据库)。

实验发现酶切得到的6个条带中都鉴定得到了蛋白质(条带6还鉴定得到了3种多肽毒素)。条带3鉴定得到的蛋白质种类最多,达到13种蛋白质。其中有6种蛋白质属于血蓝蛋白多链,包括Hemocyanin A chain、Hemocyanin C chain、Hemocyanin D chain、Hemocyanin E chain、Hemocyanin F chain和Hemocyanin G chain。另外,还鉴定得到2种钾离子通道蛋白、2种角蛋白、1种钙蛋白酶、1种AF-17蛋白和1种胰蛋白酶。胰蛋白酶和角蛋白在其他条带的鉴定中多次出现,考虑到这两种蛋白质可能是实验污染所致,故将这两种蛋白质在结果中剔除。从家福捕鸟蛛粗毒中我们共鉴定得到了14种蛋白质:血蓝蛋白、线粒体ATP合成酶、钙蛋白酶、神经软骨蛋白、钾离子通道蛋白、线粒体载体蛋白、锌指蛋白、多梳蛋白等(见表1)。在家福捕鸟 蛛粗毒中鉴定发现了血蓝蛋白,这与实验室前期研究结果类似。本室研究生在对敬钊缨毛蛛^[24]、大腹园蛛^[25]和虎纹捕鸟蛛^[26]3种蜘蛛粗毒进行质谱鉴定时均鉴定得到血蓝蛋白。

表1

Table 1

表1(Table 1)

表1 家福捕鸟蛛粗毒中蛋白质的质谱鉴定结果 Table 1 MS identification results of proteins from S. jiafu venom No. Accession Score Mass Num. of matches Num. of significant matches Num. of sequences Num. of significant sequences Description 1 HCYG_APHCL 150 72393 6 6 3 3 hemocyanin G chain 2 HCYA_APHCL 125 72843 8 8 4 4 hemocyanin A chain 3 HCYF_APHCL 86 72674 7 5 4 2 hemocyanin F chain 4 HCYD_APHCL 83 72647 7 5 4 2 hemocyanin D chain 5 HCYE_APHCL 67 72258 6 5 3 2 hemocyanin E chain 6 HCYB_APHCL 60 72622 4 2 3 2 hemocyanin B chain 7 KCNT1_HUMAN 33 140136 1 1 1 1 potassium channel subfamily T member 1 8 ATPA_BOVIN 32 59797 1 1 1 1 mitochondrial ATP synthase alpha subunit, 9 AF17_HUMAN 25 113488 1 1 1 1 protein AF-17 10 NCDN_CHICK 23 77662 1 1 1 1 neurochondrin 11 ZN707_HUMAN 23 44258 1 1 1 1 zinc finger protein 707 12 MTCH1_HUMAN 23 41859 1 1 1 1 mitochondrial carrier homolog 1 13 ASX_DROME 19 181042 1 1 1 1 polycomb protein Asx 14 CPNS1_BOVIN 18 28028 1 1 1 1 calpain small subunit 1

表1 家福捕鸟蛛粗毒中蛋白质的质谱鉴定结果 Table 1 MS identification results of proteins from S. jiafu venom