Q Exactive四极杆-静电场轨道阱高分辨质谱及DIONEX UltiMate 3000超高效液相色谱仪(Thermo Fisher公司,美国);氮吹仪(Organomation公司,美国); Preval SPE 304+全自动固相萃取装置(普立泰科公司,中国); Option-Q超纯水仪(Elga公司,美国)。

甲醇(色谱纯,Merck公司),磷酸二氢钾和氢氧化钠(分析纯,南京化学试剂厂)。3种马桑内酯标准品(羟基马桑毒素、马桑亭(coriatin)、马桑宁(corianin))的纯度均大于96%(云南西力生物技术公司);蜂蜜为新西兰进口的麦卢卡蜂蜜。

分别准确称取马桑亭、马桑宁、羟基马桑毒素标准品各10 mg(精确至0.01 mg)于10 mL容量瓶中,以甲醇定容,配制成1.0 g/L 标准储备液,于冷冻条件下保存。试验中根据需要进行稀释。

称取1.0 g样品于50 mL玻璃离心管中,加入15 mL 0.2 mol/L 磷酸缓冲溶液(pH=7.5),充分涡旋使蜂蜜样品完全溶解,过滤。

将滤液全部过(3 mL,60 mg)HLB小柱(活化:3 mL甲醇、3 mL水),上样完毕后,用3 mL水淋洗,再用5 mL甲醇洗脱,收集洗脱液至10 mL玻璃试管,40 ℃下氮气吹干。加入1.0 mL甲醇-水溶液(30 ∶ 70,v/v)溶解残渣,过有机相滤膜(0.22 μ m),待用。

流动相A为超纯水,B为甲醇。洗脱梯度程序:0～2 min,10%B; 2～5 min,10%B～90%B; 5～7.5 min,90%B; 7.5～7.8 min,90%B～10%B; 7.8～10.0 min,10%B。进样量:10 μ L;流速:0.5 mL/min;柱温:30 ℃; Phenomenex C18 100A色谱柱(100 mm×4.6 mm,2.6 μ m)。

质量分析器为Orbitrap;可加热的电喷雾离子源(HESI II),源温度为350 ℃;毛细管电压为3.5 kV;离子传输管温度为300 ℃;鞘气为50 unit,辅助气为10 unit。t-MS²扫描模式:负离子模式采集;关联Inclution list,分辨率 70 000 FWHM;碰撞池能量(NCE)为35 eV。3种马桑毒素的UPLC-Q Exactive MS分析参数见表1。

表1

Table 1

表1(Table 1)

表1 不同洗脱液洗脱能力的比较 Table 1 Comparison of elution abilities of different eluents Compound Retention time/ min Ion information Accurate mass (m/z) Daughter ions (m/z) 1 2 Tutin 5.41 [M-H]- 293.10162 109.06378* 153.05348 Corianin 5.68 [M-H]- 293.10162 161.09497* 87.00667 Coriatin 5.65 [M-H]- 295.11682 173.05858* 201.05359 * Quantitative ion.

表1 3种马桑内酯的UPLC-Q Exactive MS分析参数 Table 1 UPLC-Q Exactive MS parameters of the three coriaria lactones

蜂蜜样品含有大量糖类物质,在含水溶液中溶解性较好,马桑内酯在中性pH溶液中稳定,本实验考察了不同提取和净化方法对马桑内酯类物质的影响。A:水溶解蜂蜜样品后,用0.1 mol/L 氢氧化钠调节pH至中性,再用乙酸乙酯进行液液萃取,结果显示:液液萃取的净化效果不够充分,仪器检测时干扰很大;B:分别用pH 6～7、pH 7～8、pH 8～9的磷酸二氢钾缓冲溶液(0.2 mol/L)提取蜂蜜样品,经反相固相萃取小柱C18和HLB净化,结果显示:用pH在7～8之间的磷酸二氢钾缓冲溶液提取样品,经HLB小柱净化回收率最好。因此,本实验选择pH=7.5(±0.5)的磷酸二氢钾缓冲溶液(0.2 mol/L)和HLB小柱对样品进行提取和净化。

利用四极杆质谱对3种马桑内酯标准品进行调谐,然后测定空白试剂,发现在负离子模式下空白试剂中存在信号响应值很高、质量数为293.1的色谱峰(见图1),经高分辨质谱扫描发现此干扰物质精确质量数为 293.174 19,而羟基马桑毒素和马桑宁内酯的精确质量数为 293.101 62,四极杆质谱无法区分质量数如此接近的物质。

图1

Fig. 1

图1 空白试剂的三重四极杆质谱的色谱图 Fig.1 Chromatogram of triple quadrupole mass spectrometer for a blank solution

利用UPLC-Q Exactive对3种化合物的混合标准溶液进行负离子全扫描,发现3个信号响应值较高的色谱峰的质量数分别为293.174 19、293.101 62 和 295.116 82(见图2)。由于羟基马桑毒素和马桑宁内酯为同分异构体,理论质量数为 293.109 79,同时进样的空白试剂(超纯水、甲醇和乙腈)谱图中均发现 293.174 19 的色谱峰存在,但 293.101 62 不存在,因此确定 293.174 19 为一种干扰物质,目前尚未查明此物质来源何处,在其他实验室也发现存在此物质。

图2

Fig. 2

图2 马桑内酯标准品的UPLC-Q Exactive色谱图 Fig.2 Chromatograms of UPLC-Q Exactive for coriaria lactone standards

由于干扰物质的存在,并且羟基马桑毒素和马桑宁内酯为同分异构体,为了能够准确地定性和定量分析,比较了不同流动相组成对同分异构体的分离程度、色谱峰形和质谱信号的影响。结果表明,采用0.01%(v/v)甲酸水溶液和甲醇作为流动相,无论是色谱峰形还是质谱的信号强度都不理想。采用0.03%(v/v)氨水溶液和甲醇作为流动相进行梯度洗脱可以有更高的质谱信号,但是干扰物质的出峰时间会和羟基马桑毒素出峰时间重叠,对羟基马桑毒素的定性分析存在一定的干扰。采用水和甲醇作为流动相,在最佳分离条件下进行梯度洗脱,色谱峰形良好并且可以使干扰物质、羟基马桑毒素以及马桑宁内酯完全分开,质谱信号良好(见图3)。

图3

Fig. 3

图3 水和甲醇梯度洗脱的马桑内酯标准品的色谱图 Fig.3 Chromatograms of coriaria lactone standards with a gradient elution using pure water and methanol

最后利用t-MS²扫描模式,利用保留时间和母离子的精确质量数以及1个碎片离子的精确质量数进行定性分析,采用丰度最高的碎片离子进行定量分析。

以空白基质为稀释液配制3种马桑内酯的 系列混合标准溶液(0.05﹑0.1﹑0.2﹑0.5和1.0 mg/L) 进样分析,以外标法定量。以定量离子的峰面积(Y)作为纵坐标,以相应质量浓度(X,mg/L)作为横坐标,结果表明3种马桑内酯在0.05～1.0 mg/L 范围内均呈良好的线性关系,相关系数(r²)＞0.99。在空白样品中添加0.05、0.1和0.2 mg/kg 共3个水平的3种马桑内酯混合标准溶液,按已建立的方法测定,按3倍信噪比对应的加标水平为检出限,10倍信噪比对应的加标水平为定量限,结果见表2。

表2

Table 2

表1(Table 2)

表2 3种马桑内酯的回归方程、相关系数、线性范围、检出限及定量限 Table 2 Regression equations,correlation coefficients (r2),linear ranges,LODs and LOQs of the three coriaria lactone Compound Regression equation r2 linear range/(mg/L) LOD/(mg/kg) LOQ/(mg/kg) Tutin Y=27098+775.494X 0.9900 0.05-1.0 0.05 0.1 Corianin Y=62717.4+6774.82X 0.9975 0.05-1.0 0.05 0.1 Coriatin Y=1015150+32910.9X 0.9976 0.05-1.0 0.05 0.1 Y: peak area of quantitative ion; X: mass concentration,mg/L.

表2 3种马桑内酯的回归方程、相关系数、线性范围、检出限及定量限 Table 2 Regression equations,correlation coefficients (r2),linear ranges,LODs and LOQs of the three coriaria lactone

以空白蜂蜜样品加标的回收率表示方法的准确度,以回收率的相对标准偏差(RSD)表示方法的精密度。向空白蜂蜜样品中添加3种马桑内酯混合标准溶液,加标水平分别为0.1、0.2和0.5 mg/kg,每个加标水平样品按照1.3.1节方法处理,其回收率和RSD见表3。3种马桑内酯的平均回收率为86.3% ～95.6% ,相对标准偏差为3.0% ～8.4% 。空白加标回收结果说明方法精密度和准确度良好。

表3

Table 3

表3(Table 3)

表3 空白蜂蜜样品加标回收试验结果(n=6) Table 3 Results of recovery test of the spiked blank honey samples (n=6) Compound Spiked levels 0.1 mg/kg 0.2 mg/kg 0.5 mg/kg Recovery/ % RSD/ % Recovery/ % RSD/ % Recovery/ % RSD/ % Tutin 91.3 8.4 86.5 6.1 90.4 4.7 Corianin 87.0 4.9 86.3 3.6 88.6 3.0 Coriatin 87.7 6.9 86.6 6.1 95.6 4.3

表3 空白蜂蜜样品加标回收试验结果(n=6) Table 3 Results of recovery test of the spiked blank honey samples (n=6)

采用本文所建立的方法对新西兰进口的52批次麦卢卡蜂蜜进行测定,检出1份样品含羟基马桑毒素0.3 mg/kg。

采用超高效液相色谱-高分辨质谱检测技术建立了蜂蜜中3种马桑内酯残留的检测方法。本方法用固相萃取技术对蜂蜜样品进行了充分净化,利用色谱分离机制把2种同分异构体完全分开,通过高分辨质谱的t-MS²扫描模式进行准确的定性和定量检测。经实际样品检测的考察,该方法稳定、准确,适合于蜂蜜中马桑内酯类化合物的日常检测。