Agilent 1200型高效液相色谱仪,配二极管阵列检测器(DAD)(Agilent公司); Sigma 3-18K型低温离心机(12 000 r/min)(Sigma公司); Thermo M37610-33型涡旋混合器(Thermo公司); Milli-Q高纯水系统(Millipore公司)。0.22 μ m水系滤膜;注射过滤器。

甲醇和磷酸二氢钾(色谱纯);磷酸(分析纯);去离子水(18.2 M Ω ·cm);磷酸二氢钾溶液(0.02 mol/L,pH 3.0);维生素C、抗坏血酸葡糖苷、抗坏血酸磷酸酯镁、抗坏血酸乙基醚标准品(纯度均≥99.0% ,美国Sigma公司)。

抗坏血酸葡糖苷、抗坏血酸磷酸酯镁和抗坏血酸乙基醚分别用水溶液配成 1 000 mg/L 的标准储备液,4 ℃避光保存(有效期为1个月);维生素C用0.1%(v/v，下同)磷酸溶液配制成 1 000 mg/L 的标准储备液,当天使用前配制。移取一定体积的标准储备液用0.02 mol/L 磷酸二氢钾溶液(pH 3.0)配制成混合标准溶液,其中抗坏血酸葡糖苷和抗坏血酸磷酸酯镁的质量浓度为100 mg/L,抗坏血酸乙基醚和维生素C的质量浓度为50 mg/L。混合标准溶液现配现用。

色谱柱:YMC-Triart C18柱(250 mm×4.6 mm,5.0 μ m),日本YMC公司。流动相:A为0.02 mol/L 磷酸二氢钾溶液(pH 3.0),B为甲醇,流速为1.0 mL/min。梯度洗脱程序:0～5 min,98%A; 5～10 min,98%A～10%A; 10～12 min,10%A; 12～18 min,10%A～98%A。柱温:25 ℃;检测波长：250 nm;进样量:10 μ L。

适合化妆水、水乳液等含油脂较少的样品。准确称取约0.500 g样品于50 mL具塞比色管中,加入30 mL 0.02 mol/L 磷酸二氢钾溶液(pH 3.0),涡旋混合2 min,转移至50 mL容量瓶中,用0.02 mol/L 磷酸二氢钾溶液(pH 3.0)定容至刻度。混匀后取10 mL溶液于15 mL离心管中,在10 ℃、12 000 r/min 条件下离心10 min,上清液过0.22 μ m滤膜,滤液待测。

适合面膏等含油脂较高及凝胶类、啫喱类样品。准确称取约0.250 g样品于50 mL具塞比色管中,加入1.0 mL二氯甲烷,涡旋混合至样品均匀分散后,准确加入25 mL 0.02 mol/L 磷酸二氢钾溶液(pH 3.0),涡旋混合2 min。混匀后取10 mL溶液于15 mL离心管中,在10 ℃、12 000 r/min 条件下离心10 min,上清液过0.22 μ m滤膜,滤液待测。

被测物含量超过标准曲线的线性范围时可取适量试样滤液用提取溶剂稀释后再测定。

维生素C和抗坏血酸磷酸酯镁易溶于水,抗坏血酸葡糖苷和抗坏血酸乙基醚是亲油亲水两性物质;维生素C在碱性和中性条件下不稳定,因此考虑采用酸性溶液作为提取溶剂。化妆品基本上分为不需要乳化的液体类及需要乳化的膏霜类两大类。前者含水量高,在水溶剂中容易分散形成均匀体系;后者含有一定的油脂,密度较高,在水溶液中不易分散。对于低油脂样品,采用酸性溶液直接提取;对于高油脂不易分散的样品,用一定体积的二氯甲烷分散样品,再用酸性溶液进行提取。实验比较了0.1%磷酸溶液(pH 2.65)和流动相0.02 mol/L 磷酸二氢钾溶液(pH 3.0)作为提取溶剂的提取效果,两种提取液均能到达很好的提取效果。采用磷酸溶液提取含油脂较高的样品时提取液容易乳化,不利于过滤。因此实验选择以流动相磷酸二氢钾溶液(pH 3.0)作为提取溶剂。二氯甲烷作为样品分散剂,取样量为0.250 g时最适合加入1.0 mL。分散剂加入量过少时样品不易分散,加入量过多时影响抗坏血酸乙基醚的回收率。实验比较了二氯甲烷加入量分别为0.5、1.0、1.5 mL时的提取效果,结果表明抗坏血酸乙基醚在1.5 mL二氯甲烷中的回收率比1.0 mL时低,因此实验选择二氯甲烷的用量为1.0 mL。

维生素C、抗坏血酸葡糖苷、抗坏血酸磷酸酯镁在水溶液中容易电离,极性增强,在低比例极性调整剂(甲醇)的流动相中,3个化合物在色谱柱上保留较弱，不易完全分离,而抗坏血酸乙基醚在色谱柱保留较强,出峰较晚。实验比较了3种不同型号色谱柱(Zorbax Eclipse XDB-C18柱、Zorbax SB C18柱和YMC-Triart C18柱)对维生素C、抗坏血酸葡糖苷、抗坏血酸磷酸酯镁的分离效果。结果如图1所示,采用Zorbax Eclipse XDB-C18色谱柱分析时,抗坏血酸磷酸酯镁、抗坏血酸葡糖苷和维生素C的保留时间短,峰形较宽且分离效果不好;使用Zorbax SB C18色谱柱分析时,3个化合物峰形最好,但抗坏血酸葡糖苷和维生素C无法达到基线分离;采用YMC-Triart C18色谱柱分析时,3种化合物的保留时间较长,有利于与样品中保留较弱的杂质分离,峰形也较尖锐对称。因此实验选择YMC-Triart C18柱(250 mm×4.6 mm,5.0 μ m)作为色谱分离柱。

图1

Fig. 1

图1 抗坏血酸磷酸酯镁、抗坏血酸葡糖苷及维生素C在不同型号C18色谱柱上的分离色谱图 Fig.1 Chromatograms of AA-2P、AA-2G and VC on different types of C18 column a. Zorbax Eclipse XDB-C18 column; b. Zorbax SB C18 column; c. YMC-Triart C18 column. Peaks: 1. AA-2P; 2. AA-2G; 3. VC.

维生素C、抗坏血酸磷酸酯镁和抗坏血酸葡糖苷这3种化合物的极性较强,在C18柱上保留较弱,流动相中加入酸性的缓冲溶液可以抑制多羟基的电离,减弱极性,增强目标物在固定相上的保留,使峰形及分离效果得到很大的改善。目前报道的方法有的采用单一的磷酸盐或磷酸盐溶液加甲醇作为流动相^{[11, 12, 14]}。抗坏血酸乙基醚的极性相对较弱,采用单一的缓冲盐流动相无法将其洗脱下来,因此本实验选择酸性的磷酸二氢钾溶液和甲醇作为流动相,采用梯度洗脱。文献^[11]报道当流动相pH在2.0～3.0之间,维生素C较稳定且峰形较为理想。考虑到过低的pH对色谱柱有损害,实验选择pH 2.7和pH 3.0,并比较了分别在不同甲醇比例下维生素C、抗坏血酸磷酸酯镁和抗坏血酸葡糖苷的分离效果。从图2可以看出,在pH 3.0时,甲醇含量为2%(体积分数)时,3种化合物分离效果及峰形最好。因此,本实验采用0.02 mol/L 磷酸二氢钾溶液(pH 3.0)和甲醇作流动相,甲醇初始含量较低,将维生素C、抗坏血酸磷酸酯镁和抗坏血酸葡糖苷逐一洗脱下来后,再梯度增加甲醇比例使抗坏血酸乙基醚洗脱下来。4种化合物混合标准溶液的分离图谱见图3。

图2

Fig. 2

图2 抗坏血酸磷酸酯镁、抗坏血酸葡糖苷及维生素C在不同pH值和甲醇体积分数下的分离色谱图 Fig.2 Chromatograms of AA-2P、AA-2G and VC under different pH values and methanol volume percentages a. pH 2.7,0% methanol; b. pH 2.7,5% methanol; c. pH 2.7,2% methanol; d. pH 3.0,0% methanol; e. pH 3.0,5% methanol; f. pH 3.0,2% methanol. Peaks: 1. AA-2P; 2. AA-2G; 3. VC.

图3

Fig. 3

图3 4种化合物混合标准溶液的色谱图 Fig.3 Chromatogram of a mixture of the four compound standards

将标准溶液用0.02 mol/L 磷酸二氢钾溶液(pH 3.0)逐级稀释，在设定的色谱条件下进样测定。以峰面积(y)为纵坐标,目标化合物的质量浓度(x,mg/L)为横坐标建立标准工作曲线。定量限以10倍信噪比(S/N=10)计算。结果显示,4种化合物在各自相应的质量浓度范围内线性关系良好。其线性范围、线性方程、相关系数及定量限见表1。

在4类化妆品空白基质中添加一定浓度的标准物质进行加标回收试验,每种样品平行测定6份。实验结果表明,各组分的平均加标回收率为95.6% ～101.0% ,相对标准偏差为0.62% ～3.0%(见表2),满足日常质量检测分析的要求^[20]。

表1

Table 1

表1(Table 1)

表1 4种化合物的线性范围、线性方程、相关系数及定量限 Table 1 Linear ranges,regression equations,correlation coefficients (r2) and limits of quantification (LOQs) of the four analytes Analyte Linear range/ (mg/L) Regression equation r2 LOQ/ (g/kg) AA-2P 5.0-100 y=4.81x+0.68 0.99995 0.08 AA-2G 5.0-100 y=9.47x+0.83 0.99999 0.05 VC 2.5-50 y=14.57x-3.49 0.99995 0.06 Only VCE 2.5-50 y=12.91x-0.24 0.99999 0.04 y: peak area; x: mass concentration,mg/L.

表1 4种化合物的线性范围、线性方程、相关系数及定量限 Table 1 Linear ranges,regression equations,correlation coefficients (r2) and limits of quantification (LOQs) of the four analytes

配制质量浓度为2.5 mg/L 的混合标准溶液,在室温下避光放置14 h,每隔1 h在设定的色谱条件下测定其响应值,结果见图4。实验表明:抗坏血酸磷酸酯镁、抗坏血酸葡糖苷和抗坏血酸乙基醚溶液的稳定性较好,在7 h内目标物峰面积的RSD分别为0.79% 、0.90% 、0.45% ,14 h内目标物峰面积的RSD分别为1.46% 、1.70% 、1.18% 。维生素C溶液在前3 h内较稳定,其峰面积的RSD为0.34% ;放置3 h后迅速降解。由此可见,方法可满足样品中抗坏血酸磷酸酯镁、抗坏血酸葡糖苷和抗坏血酸乙基醚的日间批量检测;如果样品含有维生素C,在3 h内完成检测可得到准确的结果。

根据国家标准GB/T 26517-2011“化妆品中24种防腐剂的测定”^[21]考察化妆品中24种防腐剂和 其他美白祛斑剂熊果苷、曲酸、氢醌、烟酰胺和甘草

图4

Fig. 4

图4 4种化合物标准溶液的日内稳定性实验 Fig.4 Stabilities of intraday of a mixed solution of the four compound standards

采用本方法对市售的30个美白化妆品(其中22份样品标签中标识含有维生素C或其衍生物)进行了测定,其中15份样品中检出含有目标物:8份检出抗坏血酸葡糖苷,含量为0.18～0.30 g/kg; 6份检出抗坏血酸磷酸酯镁,含量为0.1～0.26 g/kg; 1份检出维生素C,含量为0.13 g/kg。从检出结果看,化妆品中美白剂含量偏低,远达不到功效作用的浓度。

表2

Table 2

表2(Table 2)

表2 4类化妆品空白基质中目标物的加标回收率和精密度(n=6) Table 2 Recoveries and precisions of the four analytes spiked in four blank matrices (n=6) Analyte Spiked/ (g/kg) Lotion Liquid Cream Gel Recovery/% RSD/% Recovery/% RSD/% Recovery/% RSD/% Recovery/% RSD/% AA-2P 0.5 96.5 2.14 98.7 1.45 101.0 0.66 98.1 1.45 1 97.5 2.14 100.3 1.03 100.3 1.03 99.8 0.78 5 98.3 1.04 96.3 1.04 97.4 1.01 97.4 1.01 AA-2G 0.5 96.5 1.91 96.4 1.32 100.5 1.11 96.8 1.49 1 97.3 2.05 97.5 1.09 97.5 1.09 98.3 0.62 5 98.6 1.24 97.6 1.24 97.1 1.02 97.1 1.02 VC 0.25 96.2 1.39 96.6 2.15 97.3 2.06 97.7 2.71 0.5 95.6 2.17 97.1 2.37 96.1 2.37 97.5 2.53 2.5 96.8 1.47 98.8 1.47 96.6 2.95 96.6 2.95 Only VCE 0.25 96.4 1.51 97.9 0.99 97.9 1.75 97.0 3.00 0.5 96.3 1.42 98.1 2.67 96.1 2.67 99.4 2.58 2.5 97.0 1.11 99.2 1.11 98.1 2.20 98.6 1.29

表2 4类化妆品空白基质中目标物的加标回收率和精密度(n=6) Table 2 Recoveries and precisions of the four analytes spiked in four blank matrices (n=6)

建立了采用高效液相色谱测定化妆品中维生素C及其3种衍生物的分析方法。该方法的操作简便、灵敏度高、重现性好,适用于多种化妆品基质,不受化妆品中其他常用美白剂和防腐剂的干扰,可用于化妆品中维生素C及其衍生物的测定。