类黄酮物质(flavonoids)是指两个苯环通过中央三碳原子相互连接的一系列化合物[ 1 ],它们广泛分布于植物中,是植物重要的次生代谢产物。类黄酮物质在很多植物体中已被证明与植物的抗虫[ 2 ]和抗病[ 3 ]能力相关。黄酮类化合物是一类生物活性很强的化合物,是一种天然的抗氧化剂,在医药、食品等领域有广泛的应用[ 4, 5 ]。烟草中类黄酮化合物(包括类黄酮糖苷及其苷元)还是烟草香味物质的重要前体,其分解产物与烟草的香气质和香气量有关[ 6 ]。在烟叶的调制、醇化和燃烧过程中,黄酮类化合物可氧化分解,赋予优雅的清香气味,增加香气量,因此它们对改善烟草制品的品质有重要的作用。
目前,关于烟草中类黄酮物质的分析检测方法已有报道。1965年,Watanabe和Wender[7]采用溶剂提取和纸色谱分离的方法从烟草花的雄蕊中分离出芸香苷、山柰酚苷、异槲皮苷、黄芪苷、槲皮素-7-O-葡萄糖苷、烟花苷等黄酮类化合物。1992年,Snook等[2]采用液相色谱系统研究了66种烟草花中的黄酮类物质,发现不同烟草花中黄酮类物质差异很大。2007年,Pang等[8]采用液相色谱-串联质谱法从烟叶中分离鉴定出芸香苷、山柰酚苷、槲皮苷等化合物。2014年,本文作者Li等[9]从烟草的叶和花中鉴定出17种类黄酮物质,其中9种为烟草中首次被鉴定出来。目前,烟草中类黄酮物质的定量分析方法主要只涉及含量最高的芸香苷和山柰酚-3-O-芸香糖苷[10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20]。这主要是由于传统的高效液相色谱法灵敏度较低,无法检测到低含量的类黄酮物质,部分类黄酮物质之前未被鉴定也是原因之一。随着人们对烟草中类黄酮物质关注的增加,建立一种类黄酮物质全面定量分析方法很有必要。
本研究以作者的前期工作为基础,对从烟草的叶和花中鉴定出的17种类黄酮物质进行定量方法研究,建立了其中12种类黄酮物质(其余5种在烟叶中未检出或未获得相关标准样品)的定量分析方法。该方法的建立对于全面关注烟叶中类黄酮物质的含量分布具有重要意义。
乙腈、甲醇、乙醇(色谱纯,德国Merck公司)。超纯水由Millipore公司的纯化系统制备。二氢山柰酚(aromadendrin)、二氢槲皮素(taxifolin)、槲皮素(quercetin)、芸香苷(quercetin-3-O-rutinoside)、山柰酚-3-O-芸香糖苷(kaempferol-3-O-rutinoside)、异鼠李素(isorhamnetin)、槲皮素-3-O-葡萄糖苷(quercetin-3-O-glucoside)、木犀草素(luteolin)、异鼠李素-3-O-葡萄糖苷(isorhamnetin-3-O-glucoside)、异鼠李素-3-O-芸香糖苷(isorhamnetin-3-O-rutinoside)、山柰酚-3-O-葡萄糖苷(kaempferol-3-O-glucoside)、柚皮素-7-O-葡萄糖苷(naringenin-7-O-glucoside)等标准物质以及黄豆苷元(daidzein)、染料木苷(genistin)、橙皮苷(hesperidin)等内标物质购买于Sigma-Aldrich, Alfa Aesar和百灵威公司。
美国Waters公司超高效液相色谱(UPLC)仪, 美国AB公司AB SCIEX 5500三重四极杆质谱仪。SB-50D超声波提取仪(宁波新芝生物科技股份有限公司); Milli-Q纯水机(美国Millipore公司), LD5-2A离心机(北京京立离心机有限公司),涡旋混匀器(荷兰Breda公司); CP2245分析天平(感量 0.000 1 g,德国Sartorious公司)。
初步估计,二氢山柰酚、二氢槲皮素、槲皮素、异鼠李素、槲皮素-3-O-葡萄糖苷、木犀草素、异鼠李素-3-O-葡萄糖苷、异鼠李素-3-O-芸香糖苷、山柰酚-3-O-葡萄糖苷、柚皮素-7-O-葡萄糖苷等物质(以下称“低浓度类黄酮”)的浓度梯度在1～10 000 μ g/L 之间,芸香苷和山柰酚-3-O-芸香糖苷(以下称“高浓度类黄酮”)的浓度梯度在0.1～100 mg/L 之间。因此先配制所有标准化合物的1 g/L 的单标准溶液(甲醇为溶剂)。分别移取100 μ L 1 g/L 的低浓度类黄酮单标准溶液以及10 mL 1 g/L 的高浓度类黄酮单标准溶液于100 mL容量瓶中,以样品提取溶液(甲醇-氯仿-水(5 ∶ 2 ∶ 2, v/v/v))定容,制成混合标准溶液。以样品甲醇-水-氯仿(5 ∶ 2 ∶ 2, v/v/v)逐级稀释混合标准溶液,制成低浓度类黄酮物质的质 量浓度为 1 000、600、400、100、60、40、10、6、4、1 μ g/L, 体积为1 mL的标准溶液。此浓度梯度对应的高浓度标准溶液梯度为100、60、40、10、6、4、1、0.6、0.4、0.1 mg/L。在所有浓度梯度的溶液中加入200 μ L内标混合液。内标混合液为1.0 mg/L 黄豆苷元、染料木苷、橙皮苷的水溶液。黄豆苷元、染料木苷、橙皮苷分别用于校正无糖基类黄酮苷元、葡萄糖基取代类黄酮和芸香糖基取代类黄酮。
样品信息:烟草品种K326、云烟87、N. rustica、N. alata、GN23、N. plumbaginifia、G285、红大、云烟85、N. lamgiflora、N. occidentalis等种植于云南省烟草农业科学研究院的“世界烟草品种园”(玉溪市研和镇)。烟叶样品为成熟期的中部烟叶。
样品制备:将新鲜的烟叶样品放入研钵,加液氮冷冻,并迅速研磨粉碎。磨好的样品迅速转入冻干机进行冷冻干燥,除去水分,置于4 ℃冰箱保存。
样品提取:准确称取10.0 mg冻干烟叶样品,加入1 mL甲醇-水-氯仿(5 ∶ 2 ∶ 2, v/v/v)和200 μ L内标混合液,超声30 min,离心,取上清液转入液相色谱进样小瓶中供分析。
色谱条件:Waters BEH C18色谱柱(150 mm×2.1 mm, 1.7 μ m；美国Waters公司);流动相:A相为水;B相为乙腈,两相中均添加0.1%(v/v)甲酸和0.2 mmol/L 乙酸铵;梯度洗脱程序:0～1.0 min,10%B;1.0～9.0 min,10%B～90%B;9.0～11.0 min,90%B～100%B;11.0～11.1 min,100%B～10%B;11.1～13.0 min,10%B。柱温:30 ℃;进样量:2 μ L;流速:0.25 mL/min。
质谱条件:电喷雾电离离子源;负离子扫描模式;喷雾电压-4 000 V;气帘气压力275.790 kPa;离子源温度700 ℃;辅助气1压力413.685 kPa;辅助气2压力344.738 kPa;去簇电压-100 V。
对比分析了乙腈-水和甲醇-水两种流动相体系,发现两者的分离效果相当,但采用甲醇-水体系时色谱系统的柱压力较大。由于本实验采用的是1.7 μ m的超高效液相色谱柱,采用甲醇-水体系时很容易使色谱系统的柱压力达到仪器耐受压力的上限103.4 MPa,造成系统的不稳定,因此实验最终采用乙腈-水流动相体系。
比较分析了乙酸铵和甲酸两种常见添加剂对类黄酮物质分离和响应的影响。结果发现,添加乙酸铵后化合物的色谱峰形得到改善,但响应灵敏度却有所降低。添加甲酸在正离子和负离子模式下均能够增加化合物的灵敏度,但会降低化合物在反相色谱柱上的保留。因此最终本实验采用0.1%甲酸和0.2 mmol/L 乙酸铵同时加入A相和B相作为色谱分离和灵敏度的改进剂。优化条件下实际样品的色谱图见图1。
采用流动注射的方法对质谱离子源参数和具体化合物的定量离子、碰撞能量等参数进行优化。其中质谱定量离子的选定原则为从标准化合物的二级质谱中初步选取4个响应较强的碎片离子,对4个离子依次进行碰撞能量的优化,得到每个离子的最佳碰撞能,对比最佳碰撞能时4个离子的信噪比,选取信噪比最大的两个离子作为本方法的定量离子。最终得到定量分析的离子源参数见1.4节。化合物的定量离子及碰撞能量参数见表1。
本实验试图找到一种简单、高效、快速的类黄酮物质提取方法,并尽可能地减少杂质的提取。比较了水、甲醇、乙醇、甲醇-水(3 ∶ 1, v/v)、乙醇-水(3 ∶ 1, v/v)、甲醇-水-氯仿(5 ∶ 2 ∶ 2, v/v/v)等多酚或类黄酮物质常用提取溶剂的提取效果。由于本研究涉及的类黄酮物质中芸香苷和山柰酚-3-O-芸香糖苷在总类黄酮物质中的含量占比较高(本实验中两者占总类黄酮含量的85%以上),只采用类黄酮峰面积总和进行方法评价无法体现含量较低的类黄酮物质的提取效果。因此本实验采用了两种不同的方法进行不同萃取方法的萃取效果比较。第一种方法为类黄酮物质色谱峰面积总和比较(见图2a),该方法中含量较高的类黄酮化合物权重较大;第二种方法为色谱峰面积在各处理之间的排序(升序)总和比较(见图2b),该方法中每个类黄酮化合物的权重相同,因此减少了芸香苷和山柰酚-3-O-芸香糖苷等高含量物质对比较结果的影响。两种比较方式得到的结果都是乙醇-水(3 ∶ 1, v/v)和甲醇-水-氯仿(5 ∶ 2 ∶ 2, v/v/v)两种溶剂的提取效果最好,且两者的提取效果差别不大。由于甲醇-水-氯仿(5 ∶ 2 ∶ 2, v/v/v)提取后可以通过离心将氯仿层去除，氯仿层萃取了大部分的叶绿素,而叶绿素等色素采用本实验的色谱条件很难将其从色谱柱上洗脱下来(反相色谱条件下通常需要用异丙醇才能将色素冲洗下来),批量进样有可能损坏色谱柱,影响类黄酮物质的正常分析,因此本实验最终选取甲醇-水-氯仿(5 ∶ 2 ∶ 2, v/v/v)作为烟叶中类黄酮物质的提取溶剂。
按照1.4节所述的方法配制系列浓度的混合标准溶液并进行标准曲线绘制,发现所有化合物的线性相关系数(r2)均在0.99以上,说明所建立的方法具有很好的线性响应,适合定量分析。对这些化合物进行检出限和定量限评估,发现不同化合物的检出限和定量限相差较大,其中异鼠李素-3-葡萄糖苷、二氢槲皮素、柚皮素-7-葡萄糖、二氢山柰酚、异鼠李素-3-O-芸香糖苷、山柰酚-3-O-葡萄糖苷、槲皮素-3-O-葡萄糖苷的定量限可达到1.2～5.6 μ g/L,而槲皮素-3-O-芸香苷、山柰酚-3-O-芸香苷以及木犀草素、异鼠李素、槲皮素的定量限在0.065～0.4 mg/L 之间(见表2)。对类黄酮物质进行重复性考察,发现所考察的类黄酮物质的日内重复性在3.5% ～7.4%之间,日间重复性在5.2% ～11.4%之间(见表3)。根据类黄酮物质在本实验所测定的11种烟草中的平均浓度,添加约50%和100%平均浓度的标准样品至实际样品中，测得方法的回收率在81.2% ～111.9%之间(见表3)。
利用所建立的类黄酮物质定量方法,分析了11种烟叶中类黄酮物质的含量,结果发现不同品种烟叶中类黄酮物质的总含量差异很大,其中N. alata中的含量最低,为0.38 mg/g; N. rustica中的含量最高,达14.3 mg/g (见图3)。从各种类黄酮物质的含量看,芸香苷和山柰酚-3-O-芸香糖苷是含量较高的类黄酮物质,二氢山柰酚、异鼠李素-3-O-葡萄糖苷、柚皮素-7-O-葡萄糖苷等含量较低。芦丁、槲皮素-3-O-葡萄糖苷、山柰酚-3-O-芸香糖苷、异鼠李素-3-O-葡萄糖苷、山柰酚-3-O-葡萄糖苷、异鼠李素-3-O-芸香糖苷、二氢槲皮素、柚皮素-7-O-葡萄糖苷、 二氢山柰酚、木犀草素、槲皮素、异鼠李素等类黄酮物质分别在N. alata(0.14 mg/g), N. plumbaginifia(11.30 μ g/g), N. alata(0.07 mg/g), N. plumbaginifia(0.79 μ g/g), N. alata(2.12 μ g/g), N. plumbaginifia(4.24 μ g/g),云烟85(0.77 μ g/g), N. rustica(0.16 μ g/g),云烟85(未检出),云烟85、N. lamgiflora、N. occidentalis(均未检出),云烟87(35.94 μ g/g),云烟85、N. plumbaginifia、N. lamgiflora、 N. occidentalis(均未检出)中含量最低;在N. rusti- ca(13.33 mg/g)、N. lamgiflora(221.68 μ g/g)、N. plumbaginifia(2.32 mg/g)、GN23(2.55 μ g/g)、N. plumbaginifia(28.74 μ g/g)、GN23(87.42 μ g/g)、N. alata(4.50 μ g/g)、GN23(3.31 μ g/g)、N. alata(0.90 μ g/g)、K326(50.19 μ g/g)、N. rustica(46.88 μ g/g)、K326(51.09 μ g/g)中含量最高。
对类黄酮物质在11种不同品种烟叶中的含量分布进行皮尔森相关关系研究(见表4)，结果发现,芸香苷与槲皮素-3-O-葡萄糖苷、槲皮素等化合物呈显著正相关关系,山柰酚-3-O-芸香糖苷与山柰酚-3-O-葡萄糖苷呈显著正相关关系,异鼠李素-3-O-葡萄糖苷与异鼠李素-3-O-芸香糖苷、异鼠李素等化合物呈显著正相关关系。从化学结构上看它们之间只存在糖基的差别,而类黄酮苷元是糖苷生成的原料化合物,因此苷元的含量决定了糖苷的含量。而含相同苷元的不同糖苷之间的正相关关系说明不同糖苷(含相同苷元)的生成化学反应之间不存在竞争关系。异鼠李素与木犀草素、槲皮素与二氢槲皮素、二氢槲皮素与二氢山柰酚之间存在显著正相关关系,从化学结构上看它们之间只存在一个基团的差别,它们的含量应是由共同的上游原料决定的,且它们生成的化学反应之间也不存在竞争关系。
本研究建立了一种基于UPLC-MS/MS的烟叶中12种类黄酮物质的定量分析方法。该方法将现有类黄酮分析方法的分析指标从2个扩展到12个。方法简单、快速、准确、覆盖面广。将所建立的方法用于11种不同烟叶的分析,发现不同烟叶之间的类黄酮物质含量相差很大,而结构相似的类黄酮物质在烟叶中的含量分布存在正相关关系。该方法的建立对开展烟草类黄酮物质的相关研究具有重要的参考意义。
2015, Vol. 33 Issue (7): 746-752
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