色谱  2015, Vol. 33 Issue (7): 730-739   PDF (945 KB)    
扩展功能
加入收藏夹
复制引文信息
加入引用管理器
Email Alert
RSS
本文作者相关文章
王硕
张向明
张晶
邵兵
李书明
超高效液相色谱-电喷雾串联质谱法测定生活饮用水中49种药物及5种代谢物
王硕1, 张向明1, 张晶2, 邵兵2, 李书明1     
1. 朝阳区疾病预防控制中心, 北京 100021;
2. 北京市疾病预防控制中心, 食物中毒诊断溯源技术北京市重点实验室, 北京 100013
收稿日期：2015-03-16
基金项目：首都卫生行业发展专项(2011-7023-02).
通讯作者：李书明, E-mail: kszz_001@126.com
摘要：建立了超高效液相色谱-电喷雾串联质谱(UPLC-ESI MS/MS)分析生活饮用水中54种药物的方法。采用HLB固相萃取柱对水样中的目标化合物进行富集净化,以5 mL甲醇洗脱;洗脱液用氮气吹至近干,用0.4 mL 0.1%甲酸水溶液定容,上机分析;ACQUITY UPLCTMBEH C18柱用作色谱分离,以0.1%甲酸水溶液-甲醇为流动相进行梯度洗脱;多反应监测(MRM)模式进行检测;目标药物使用基质外标法定量。54种药物在自备井水、市政末梢水和地表水中的加标回收率分别为58.7%~104.4%、53.1%~109.5%和50.7%~118.8%,相对标准偏差(n=6)分别为0.3%~12.8%、1.0%~15.5%和0.4%~19.3%;方法定量限为0.002~5.000 ng/L。将建立的方法应用于北京部分自备井水、市政末梢水和地表水样品的分析,结果在自备井水样中检出26种药物。
关键词： 固相萃取     超高效液相色谱-电喷雾串联质谱法     药物     代谢物     生活饮用水    
Determination of 49 drugs and 5 metabolites in drinking water samples using ultra-high performance liquid chromatography- electrospray ionization tandem mass spectrometry
WANG Shuo1, ZHANG Xiangming1, ZHANG Jing2, SHAO Bing2, LI Shuming1     
1. Chaoyang District Center for the Disease Control and Prevention, Beijing 100021, China;
2. Beijing Key Laboratory of Diagnostic and Traceability Technologies for the Food Poisoning, Beijing Center for the Disease Control and Prevention, Beijing 100013, China
Received: 2015-03-16
Abstract: A method for the determination of 54 drugs in drinking water samples was developed by using ultra-high performance liquid chromatography-electrospray ionization tandem mass spectrometry (UPLC-ESI MS/MS). The target drugs in drinking water samples were enriched and cleaned-up by HLB solid-phase extraction (SPE) cartridges and then eluted with 5 mL methanol. The elute was collected, concentrated under a gentle stream of nitrogen gas, diluted with 0.4 mL 0.1% formic acid solution, and analyzed by UPLC-ESI MS/MS. The separation of the 54 drugs was performed on an ACQUITY UPLCTMBEH C18 column using mobile phases of 0.1% formic acid and methanol by gradient elution. The multiple reaction monitoring (MRM) mode was employed in mass spectrometry acquisition. The matrix-matched external standard calibration was used for quantitation. The results showed that the average recoveries of the drugs in ground water, tap water and surface water were 58.7%-104.4%, 53.1%-109.5%, and 50.7%-118.8%, respectively, and the corresponding relative standard deviations (RSD, n=6) were 0.3%-12.8%, 1.0%-15.5%, and 0.4%-19.3%, respectively. The method quantification limits (MQL) for target compounds were in the range of 0.002-5.000 ng/L. The developed method was applied to analyze the water samples from Beijing. The results showed that 26 drugs were detected in ground water samples.
Key words: solid-phase extraction (SPE)     ultra-high performance liquid chromatography-electrospray ionization tandem mass spectrometry (UPLC-ESI MS/MS)     drugs     metabolites     drinking water    

近年来,药品和个人护理品(PPCPs)作为环境新型污染物受到了广泛关注。据统计,现有超过 3 000 种药物用于人类医疗和畜牧养殖[1]。我国是药品生产和使用大国,尤其是抗生素类药物,据报道2003年抗生素的产量突破了2万吨[2]。这些药物使用后,经动物排泄、废水处理等不同途径进入环境[3],可能会引发致癌、致畸等一系列问题。目前在饮用水[4]、生活污水[5]、市政用水[6]和地表水[7,8]等多种水环境中均检出了多种PPCPs化合物。Lindberg等[9]研究表明,污水中含有多种抗生素类药物且污水处理厂对这些药物的去除率较低,大部分药物亲水性较强,易通过地表径流与渗滤污染地下水与人类的饮用水水源,因此,这些药物在生活饮用水中的检出频率较高,给人类健康和生态环境造成严重危害[3, 7, 10, 11]。此外,磺胺类药物在生物体内主要代谢为乙酰类化合物,随着生物体排泄进入到环境中。有研究表明,虽然这些代谢产物的抗菌活性在进入环境后减弱,但当环境中有细菌存在时,乙酰化代谢物仍可转变回原形存在于环境中,从而引发细菌耐药性等一系列环境问题[3,12]。国外对环境水体中磺胺代谢物的存在水平已有一些研究,在地表水[13,14,15]、地下水[13]、瓶装水[13]及污水[15,16]中均检出残留,且乙酰化代谢物在水体中的检出浓度高于其原形药物[14],含量为50～2 200 ng/L[13]。

我国对生活饮用水系统中PPCPs的存在水平报道较少[4,17],多集中在地表水和污水的研究[7, 8, 10, 18]。Yi等[4]调查了广州和澳门地区的市政末梢水,均检出了环丙沙星、诺氟沙星、洛美沙星和恩诺沙星,其中环丙沙星的质量浓度为679.7 ng/L,且检出率达77.5%以上。喻峥嵘等[17]分别在水源水、净水厂原水和小区管网水中检出11、12和5种PPCPs,质量浓度最高为12.35 ng/L。因此,为了解北京饮用水中药物的存在水平和污染现状,建立一种方法可以同时测定生活饮用水中多种类药物及其代谢产物是有必要的。

本文参考文献[5, 7, 8],根据目前在我国环境中PPCPs暴露的浓度水平,选取了7类49种药物及5种磺胺代谢物为研究对象,利用Oasis HLB固相萃取柱富集净化,UPLC-MS/MS检测,建立了生活饮用水中多种PPCPs快速、准确的定量方法,并对北京市部分生活饮用水中多种药物及其代谢产物进行了检测。

1 实验部分
1.1 仪器、试剂与材料

ACQUITYTM超高效液相色谱仪(Waters公司)、3200Q-Trap质谱仪(AB SCIEX公司),Oasis HLB固相萃取柱(6 mL,200 mg)、Oasis MCX固相萃取柱(6 mL,150 mg)、Oasis MAX固相萃取柱(6 mL,150 mg)、C18固相萃取柱(6 mL,500 mg)(Waters公司)。

甲醇、乙腈(色谱纯,Fisher Scientific公司),甲酸(纯度为99% ,Acros Organics公司),氨水、盐酸(优级纯,北京化学试剂公司),实验室用水均为超纯水,电阻率为18.2 M Ω ·cm (Millipore超纯水机制备)。

49种药物(见表1)购自Dr. Ehrenstorfer公司(Augsburg,Germany),5种磺胺的代谢物购自Toronto Research Chemicals Inc. (Toronto,Canada),纯度均高于97% 。

表1 54种药物的质谱采集参数 Table 1 MS parameters of the 54 compounds

以甲醇为溶剂分别配制质量浓度为 1 000 mg/L 的标准储备液,于-18 ℃保存。临用时配制成不同浓度的基质匹配标准工作液。

1.2 仪器条件
1.2.1 色谱条件

Waters ACQUITY UPLCTMBEH C18柱(100 mm×2.1 mm,1.7 μ m; Waters,USA);流动相A: 0.1%甲酸水溶液;B:甲醇;流速:0.3 mL/min;梯度洗脱条件:0～3 min,5%B～20%B; 3～8 min,20%B～30%B; 8～12 min,30%B～35%B; 12～15 min,35%B～70%B; 15～16.5 min,70%B～95%B; 16.5～17 min,95%B～5%B; 17～20 min,5%B。柱温:30 ℃;进样体积:10 μ L。

1.2.2 质谱条件

采用电喷雾电离正离子模式(ESI(+))。喷雾电压 5 500 V;雾化温度500 ℃;雾化气压力3.74×103 Pa;碰撞气(CAD): Medium; 54种药物的多反应监测(MRM)参数见表1。

1.3 样品前处理

环境水样经0.45 μ m滤膜过滤后,量取400 mL,加入10 mg抗坏血酸钠,加入0.5 g Na2EDTA超声至完全溶解,用盐酸调节pH值至3,水样以大约10 mL/min 的速度过HLB柱(分别用5 mL甲醇,5 mL 0.1% Na2EDTA水溶液(pH 3)活化)。水样过柱后,用5 mL超纯水淋洗,最后用5 mL甲醇洗脱;洗脱液用氮气吹至近干,用0.4 mL 0.1%甲酸水溶液定容,涡旋混匀1 min,转移至2 mL样品瓶中,用LC-ESI MS/MS测定。

2 结果与讨论
2.1 水样保存条件的优化

有研究表明,在使用大量氯消毒的市政末梢水中,抗生素可与游离余氯发生氯化反应,为了准确测定生活饮用水中多种药物的含量,须使用掩蔽剂去除游离余氯对抗生素类药物的影响[19]。通常,在生活饮用水(余氯含量为1 mg/L)中加入过量抗坏血酸钠(25 mg/L)或亚硫酸钠(20 mg/L)可去除游离余氯对抗生素测定的干扰。本研究采集的水样(自备井水和市政末梢水)经测定余氯含量为0.7～1.0 mg/L,比较了抗坏血酸钠的加入对生活饮用水中抗生素类药物含量的影响。取两份100 mL水样,加入混合标准溶液,使水样中抗生素类药物的质量浓度为10 μ g/L,其中1份加入过量抗坏血酸钠(25 mg/L)。将两份水样连续测定7天。实验结果表明,加入抗坏血酸钠后,抗生素类药物的测定值7天内稳定且明显高于未加入抗坏血酸钠的水样。因此,在采集水样时,应及时加入过量抗坏血酸钠(25 mg/L),水样可保存7天。

2.2 SPE条件的优化

本实验采用固相萃取技术对水样中的目标化合物进行富集和净化,由于这些药物多为两性化合物,pKa范围在5～8之间,且同一化合物在酸性、中性和碱性条件下的存在状态不同。因此,通过不同pH值的上样液(pH值为3、5、7和9)比较了不同性质的SPE柱:HLB柱、C18柱、MAX柱和MCX柱。实验结果表明:当上样液pH值为5、7和9时,4种SPE柱上的提取效率在50% ～120%之间的药物数量只有20% ～80% 。当上样液pH值为3时,药物经过HLB柱后的绝对回收率均高于50% ,分别为:磺胺及其代谢物68.0% ～97.3% ,喹诺酮类61.3% ～105.0% ,大环内酯类50.9% ～89.3% ,四环素类95.9% ～120.0% ,β -受体阻断剂54.5% ～109.4% ,β -受体激动剂50.6% ～111.8% ,利尿剂113.0% 。而使用C18柱,磺胺及其代谢物和喹诺酮类药物的回收率均低于50% ; 使用MAX柱和MCX柱分别只有21种和41种药物的回收率大于50% 。这可能是由于药物在酸性条件下保持非解离状态,可以在HLB柱上得到较好的保留,与文献研究结果[13]一致。因此,本研究选用上样液的pH值为3,采用HLB柱进行富集净化。

2.3 Na2EDTA加入量的优化

由于喹诺酮类和四环素类药物可与水中的二价金属离子配合,从而影响这两类药物的提取效果。在上样液中加入适量Na2EDTA可以明显改善提取效果[20]。根据EDTA的酸效应曲线,当使用pH值较高的上样液时,Na2EDTA不能配合大部分金属离子,只有Mg和Sr在pH值为10的溶液中可以被配合。当上样液pH值为3时,Na2EDTA可以配合溶液中的大部分金属离子,因此,在确定固相萃取柱后,对上样液的Na2EDTA加入量进行了考察。在上样液中分别加入0、0.1、0.2、0.5和1.0 g Na2EDTA进行测试。实验结果表明:Na2EDTA加入量由0 g增加到0.5 g时,四环素类药物的提取效率明显提高了20% ,而其他药物的提取效率没有明显改变。因此,本研究选择加入0.5 g Na2EDTA进行实验。

2.4 线性范围和检出限

54种药物使用外标法定量,分别配制自备井水、市政末梢水和地表水基质匹配系列标准工作曲线。3种基质的混合标准工作曲线的质量浓度为0.5～500 ng/L,在相应质量浓度范围内,其线性相关系数均大于0.99。自备井水、市政末梢水和地表水水样的基质效应分别为60.9% ～138.1% ,69.5% ～110.2%和65.3% ～110.6%(见表2)。基质效应的计算公式为:基质效应=样品基质中添加相同含量目标化合物的响应值/纯溶剂中目标化合物的响应值×100% 。以能产生峰对峰S/N=3和S/N=10对应的药物浓度分别定义为方法检出限(MDL)与方法定量限(MQL);对于水样中未检出的药物,以基质加标的方法,通过低浓度加标水平的检测结果进行计算。分别获得自备井水、市政末梢水和地表水样中目标化合物的MQL为0.002～5.000 ng/L,0.003～5.000 ng/L,0.003～5.000 ng/L(见表2),MDL为 0.000 7～1.670 0 ng/L,0.001 0～1.670 0 ng/L,0.001 0～1.670 0 ng/L,与已有的文献相比,本方法的检出限处于较低或相当的水平[4, 7, 13]。

表2 自备井水、市政末梢水和地表水中54种药物的加标回收率、相对标准偏差、定量限和基质效应(n=6) Table 2 Recoveries,relative standard deviations (RSDs),method quantification limits (MQLs) and matrix effects of the target compounds in ground water,tap water and surface water at three spiked concentrations (n=6)

2.5 方法的准确度与精密度

分别用自备井水、市政末梢水和地表水样品进行加标回收率试验,设低、中、高3个加标浓度,每个浓度设6个平行。浓度水平及结果见表2。自备井水、市政末梢水和地表水中54种目标化合物的平均回收率分别为58.7% ～104.4% 、53.1% ～109.5% 、50.7% ～118.8% ,相对标准偏差(RSD)分别为0.3% ～12.8% 、1.0% ～15.5% 、0.4% ～19.3% ,说明该方法具有较好的准确度和精密度。

2.6 实际水样分析

应用本方法采集北京部分自备井水45份、市政末梢水20份和地表水5份进行检测,结果见图1和表3。在自备井水中共有26种药物检出,其中包括11种磺胺及其代谢物、3种大环内酯、9种喹诺酮和3种 β -受体阻断剂。检出频率大于40%的药物共有5种,2种大环内酯(CLA和ROX)和3种喹诺酮(GAT、OFX和FLE)。其中CLA和ROX在自备井水中为100%检出,最高质量浓度分别为3.210 ng/L 和2.930 ng/L。GAT、OFX和FLE的最大质量浓度分别为2.930、5.980 ng/L 和49.890 ng/L,FLE的浓度水平远高于北京河道的浓度水平(2.69 ng/L)[7]。对于磺胺类药物,本研究检出的种类与Díaz-Cruz等[13]的研究结果有明显不同,Díaz-Cruz等在研究地下水时只检出了2种磺胺类药物(SDM: 0.2 ng/L; SMX: 9.9 ng/L),而本研究共检出11种,最高质量浓度3.990 ng/L (SDZ),SDZ的检测结果与北京河道中检出的磺胺结果一致,但浓度水平低于河道的检测结果(SDZ: 715 ng/L)[7]。对于地表水和市政末梢水,所有目标化合物的浓度均小于最低检出限,优于广州的地表水的检测结果(CIP: 6～679.7 ng/L,ENR: 0～8.3 ng/L)和澳门市政末梢水的检测结果(CIP: 2～8.2 ng/L,ENR: 2.8～5.2 ng/L)[4]。而Ye等[19]在北卡罗来纳州的3个饮用水厂的出水调查中检出了低浓度的磺胺类(SMX: 3.0～3.4 ng/L)、大环内酯类(ROX、TYL、ERY: 1.4～4.9 ng/L)和喹诺酮类(OXO、FLUM: 1.2～4.0 ng/L)抗生素。

图1 (a)药物标准品和(b)自备井水样品的总离子流图(TIC) Fig.1 TIC chromatograms of (a) the drug standard solution and (b) a groundwater sample

表3 自备井水样品中药物的检测结果 Table 3 Results of the drugs in groundwater samples

1999-2000年间,美国地质调查局对美国139条河流中包括PPCPs在内的95种水体有机污染物进行了调查,检出6种抗生素,检出频率在40% ～ 50%且最大浓度达到 μ g/L级[21,22],而本研究在自备井水中所检出药物的浓度水平略低,但检出的种类多,且检出频率(TMP、SMA、AZI和CIP)远高于美国,这可能与不同地区药物使用的差异性有关,也可能意味着部分自备井水普遍受到药物的污染。

总而言之,在这几类药物中,喹诺酮类药物检出的浓度水平最高,其次是大环内酯类、磺胺类和 β -受体阻断剂类药物(见表3)。除 β -受体阻断剂类外,其他3类药物的检出频率大于50% ,同时也在超过50%的水样中检出。这4类药物的质量浓度(中值)分别为0.950、1.010、0.100和0.013 ng/L,最高质量浓度达到348.440 ng/L,虽然饮用水中检出的药物种类多,但是要判定其风险并进行评估,还需了解更多饮用水中PPCPs化合物的浓度水平及人群的消费量。因此,未来在药物与个人护理品的环境污染领域中可以关注对人群的风险评估。

3 结论

本研究建立了生活饮用水中49种药物和5种 磺胺代谢物残留的超高效液相色谱-电喷雾串联质 谱测定方法。使用HLB固相萃取柱对环境水样进行富集净化。该方法具有较高的灵敏度和准确性。将其应用于自备井水、市政末梢水和地表水中药物残留分析,检出多种药物,其中环丙沙星含量最高。

参考文献
[1]Richardson B J, Lam P K S, Martin M. Mar Pollut Bull, 2005, 50: 913  
[2]Zhang L. China Pharmacy (张伦. 中国药房), 2005, 16(8): 571   
[3]García-Galán M J, Díaz-Cruz M S, Barceló D. Trends Anal Chem, 2008, 27(11): 1008  
[4]Yi R H, Wang Q J, Mo C H, et al. Environ Pollut, 2010, 158: 2350  
[5]Shao B, Chen D, Zhang J, et al. J Chromatogr A, 2009, 1216: 8312  
[6]Jia Y Y, Tan J H, Xu C, et al. Chinese Journal of Chromatography (贾妍艳, 谭建华, 徐晨, 等. 色谱), 2014, 32(3): 263
[7]Gao L H, Shi Y L, Li W H, et al. Chinese Journal of Chromatography (高立红, 史亚利, 厉文辉, 等. 色谱), 2010, 28(5): 491  
[8]Zhu S C, Wang J, Shao W W, et al. Chinese Journal of Chromatography (朱赛嫦, 王静, 邵卫伟, 等. 色谱), 2013, 31(1): 15  
[9]Lindberg R H, Wennberg P, Johansson M I, et al. Environ Sci Technol, 2005, 39(10): 3421  
[10]Liu J L, Wong M H. Environ Int, 2013, 59: 208  
[11]Baran W, Adamek E, Ziemiańska J, et al. J Hazard Mater, 2011, 196(30): 1
[12]García-Galán M J, Blancon S G, Roldán R L, et al. Sci Total Environ, 2012, 437(15): 403
[13]Díaz-Cruz M S, García-Galán M J, Barceló D. J Chromatogr A, 2008, 1193: 50  
[14]Stoob K, Singer H P, Goetz C W, et al. J Chromatogr A, 2005, 1097: 138  
[15]Payán M R, López M A B, Fernández-Torres R, et al. J Chromatogr B, 2011, 879(2): 197  
[16]Le-Minh N, Stuetz R M, Khan S J. Talanta, 2012, 89: 407  
[17]Yu Z R, Qiao T J, Zhang X H. Chinese Journal of Water Supply and Drainage (喻峥嵘, 乔铁军, 张锡辉. 给水排水), 2010, 36(9): 24
[18]Lü M, Sun Q, Li Y, et al. Journal of Xiamen University: Natural Science (吕敏, 孙倩, 李妍, 等. 厦门大学学报: 自然科学版), 2012, 51(6): 1047   
[19]Ye Z Q, Weinberg H S. Anal Chem, 2007, 79: 1135  
[20]Shi L, Zhou X F, Zhang Y L. Water Sci Technol, 2009, 59(4): 805  
[21]Barnes K K, Kolpin D W, Furlong E T, et al. Sci Total Environ, 2008, 402(2/3): 192
[22]Focazio M J, Kolpin D W, Barnes K K, et al. Sci Total Environ, 2008, 402(2/3): 201