色谱  2015, Vol. 33 Issue (7): 704-710   PDF (812 KB)    
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毕言锋
王亦琳
叶妮
孙雷
王鹤佳
徐士新
肖希龙
超高效液相色谱-四极杆-飞行时间质谱检测和鉴定猪尿中氯丙那林的主要代谢产物
毕言锋1,2 , 王亦琳1, 叶妮1, 孙雷1, 王鹤佳1, 徐士新1, 肖希龙2    
1. 中国兽医药品监察所, 国家兽药残留基准实验室, 北京 100081;
2. 中国农业大学动物医学院, 北京 100193
收稿日期：2015-03-16
基金项目：国家自然科学基金青年基金项目(31201947).
通讯作者：毕言锋, E-mail: ivdcbyf@163.com
摘要：采用超高效液相色谱-四极杆-飞行时间质谱(UPLC/Q-TOF MS)检测和鉴定了猪尿中氯丙那林的主要代谢产物,并讨论了氯丙那林在猪体内的主要代谢途径。按10 mg/kg(b. w.)的剂量口服灌食氯丙那林,分别采集给药前及给药后的猪尿液样品。采用UPLC/Q-TOF MS对样品进行分析,并应用质量亏损过滤和离子色谱峰提取等数据处理技术,在给药后24 h内的猪尿中检测和鉴定了9种氯丙那林的代谢产物,其中,Ⅰ相代谢产物2种,Ⅱ相代谢产物7种。然后,根据氯丙那林原形和代谢产物的碎片离子特征,对代谢产物的结构进行鉴定。最后,根据所鉴定的代谢产物,推测氯丙那林在猪体内的代谢途径包括苯环羟基化、β -羟基和仲氨基的葡萄糖醛酸轭合、羟基化后的葡萄糖醛酸和硫酸轭合等。研究结果表明,羟基化氯丙那林及其轭合产物的相对含量大于60%,明显高于氯丙那林原形及其轭合产物,是尿液中的主要代谢产物。本研究将为确定氯丙那林在动物体内的残留标示物及加强对氯丙那林非法使用的监控提供科学依据。
关键词： 超高效液相色谱-四极杆-飞行时间质谱     氯丙那林     代谢产物     猪尿    
Detection and identification of major metabolites of clorprenaline in swine urine using ultra-performance liquid chromatography- quadrupole time-of-flight mass spectrometry
BI Yanfeng1,2 , WANG Yilin1, YE Ni1, SUN Lei1, WANG Hejia1, XU Shixin1, XIAO Xilong2    
1. China Institute of Veterinary Drug Control, National Reference Laboratories of Veterinary Drug Residue, Beijing 100081, China;
2. College of Veterinary Medicine, China Agricultural University, Beijing 100193, China
Received: 2015-03-16
Abstract: This study was conducted to detect and identify the metabolites of clorprenaline in swine urine using ultra-performance liquid chromatography-quadrupole time-of-flight mass spectrometry (UPLC/Q-TOF MS), and the major metabolic pathways of clorprenaline were proposed. The swines were administered a single dose each of 10 mg/kg b. w. clorprenaline by oral gavage. The urine samples were collected before and after administration. After a simple preparation, the urine samples were analyzed using UPLC/Q-TOF MS. Combined with data processing techniques including extracted ion chromatography (EIC) and mass defect filtering (MDF), two phase Ⅰ and seven phase Ⅱ metabolites were detected in the urine samples collected 0-24 h after administration. The structures of detected metabolites were elucidated by comparing their characteristic product ions with those of the parent clorprenaline. Based on the identified metabolites, the metabolic pathways of clorprenaline included hydroxylation, glucuronidation and sulphate conjugates. Among those detected metabolites, hydroxylated-clorprenaline and its conjugates were responsible for over 60% of the total MS responses, much greater than those of clorprenaline, and were proposed as the primary metabolites in swine urine. This study can provide scientific basis for determining appropriate marker residues of clorprenaline, and facilitate to effectively control clorprenaline residues in animals.
Key words: ultra-performance liquid chromatography-quadrupole time-of-flight mass spectrometry (UPLC/Q-TOF MS)     clorprenaline     metabolites     swine urine    

β -肾上腺受体激动剂( β -adrenergic agonists,β -AAs)是临床上常用的一类平喘药物。有研究发现,当使用剂量是推荐治疗剂量的5～10倍时,克伦特罗、西马特罗等 β -AAs能促进动物脂肪代谢,并增加蛋白合成,具有明显的“营养再分配”作用[1,2,3]。因此,多种 β -AAs类化合物先后在养殖中作为促生长剂被大量使用,在我国也被称为“瘦肉精”。然而,由于克伦特罗残留在欧洲多个国家导致了多起食品中毒事故,欧盟、中国等先后禁止 β -AAs物质用作食品动物促生长剂[4,5]。近年来,作为新的“瘦肉精”替代品,β -AAs类化合物氯丙那林(CLO)也被发现非法添加于饲料中[6]。同时,还出现了兽药制剂中添加氯丙那林的违法事件。为了保障动物源食品安全,农业部1519号公告已经禁止盐酸氯丙那林等在饲料和动物饮水中使用[7]。

在分子结构上,β -AAs类化合物一般具有苯乙醇胺(phenylethanolamine,PEA)母核以及不同的N-取代基(见图1)。Smith等[8]的研究表明,苯环取代基类型是决定 β -AAs类化合物代谢特点的关键因素。当PEA的苯环上有羟基(苯酚型,如莱克多巴胺、沙丁胺醇等)时,动物体内的主要代谢途径是酚羟基的葡萄糖醛酸或硫酸轭合,且轭合代谢产物是体内的主要残留形式。而对于克伦特罗等苯环取代基为氨基(苯胺型)的 β -AAs,在动物体内可能发生氧化、轭合代谢,但主要残留形式为未代谢的原形。在检测动物尿液和组织中 β -AAs残留时,一般先对样品进行水解,然后测定游离态β -AAs原形的总量[9,10,11,12]。

氯丙那林分子(结构式见图1a)的苯环上只有一个氯取代基,既不属于苯胺型,也不属于苯酚型。因此,氯丙那林在动物体内的主要代谢途径可能与其他 β -AAs类化合物不同。目前,氯丙那林在猪、牛等家畜体内的代谢研究还是空白,而在一些专门针对氯丙那林的残留分析方法中[13,14],并未对样品进行酶解,且直接将原形作为检测目标物。在本研究中,将利用超高效液相色谱-四极杆-飞行时间质谱(UPLC/Q-TOF MS)技术,检测和鉴定猪口服氯丙那林后尿液中的主要代谢产物,研究氯丙那林在猪体内的主要代谢途径。

图1 (a)氯丙那林、(b)克伦特罗和(c)莱克多巴胺的分子结构 Fig.1 Structures of (a) clorprenaline,(b) clenbuterol and (c) ractopamine
1 实验部分
1.1 仪器与试剂

超高效液相色谱-四极杆-飞行时间质谱仪(Waters Acquity UPLC-SYNAPT HDMS,美国Waters公司);猪代谢笼(北京人和机械厂);高速离心机(德国Thermo公司);涡旋振荡器(MS-3,德国IKA公司);氯丙那林(含量＞95% ,中国食品药品检定研究院);乙腈(HPLC级,美国Thermo Fisher Scientific公司);甲酸(分析纯,北京试剂公司)

1.2 样品采集及处理

长白猪(购自北京市苏家坨养殖场),体重30～40 kg。代谢实验前,动物在代谢笼中适应一周,饲喂空白饲料,自由饮水。给药前禁食12 h,不禁水。按10 mg/kg (b. w.)的剂量,口服给药一次。给药后,自由采食进水。收集给药前12 h内的尿液,作为空白样品。收集给药后24 h内的尿液,8 000 r/min 离心10 min,取上清液于-20 ℃冷冻保存。

取以上样品500 μ L于5 mL塑料离心管中,加入乙腈溶液2.0 mL,充分涡旋振荡后,以 5 000 r/min 离心10 min,转移上清液。按照以上方法,重复提取一次。合并上清液,在50 ℃氮气流下浓缩至小于0.5 mL。用水定容至0.5 mL后,以 12 000 r/min 离心10 min,取上清液过0.22 μ m滤膜后,供UPLC/Q-TOF MS分析。

1.3 UPLC/Q-TOF MS条件

色谱柱采用ACQUITY HSS T3柱(100 mm×2.1 mm,1.7 μ m),柱温30 ℃,流速0.400 mL/min,进样体积2 μ L。流动相A为含0.1%甲酸的乙腈,流动相B为含0.1%甲酸的水溶液,梯度洗脱程序如下:0～1.0 min,保持2%A; 1.0～5.0 min,流动相A的比例由2%线性变化至30% ; 5.0～7.0 min,流动相A的比例由30%线性变化至60% ; 7.0～9.0 min,流动相A的比例保持95% ; 9.0～11.0 min,保持流动相A的比例为2% 。

Q-TOF MS采用电喷雾正离子源(ESI+);毛细管电压3.0 kV;电离源温度120 ℃,锥孔电压20 V,数据采集质量范围为50～1 000 Da;数据采集方式为MSE模式,一级质谱(MS)碰撞能量为4 eV,二级质谱(MS/MS)碰撞能量为10～30 eV。检测前,采用甲酸钠溶液进行精确质量校正,并用亮氨酸-脑啡肽溶液([M+H]+,m/z 556.277 1 Da)进行实时质量锁定。

1.4 代谢物检测和结构鉴定

采用MetaboLynx XS软件对UPLC/Q-TOF MS采集的数据进行处理。首先,对数据进行质量亏损过滤(MDF)处理,消除内源性代谢物的干扰。在MDF处理时,以氯丙那林(C11H17NOCl,[M+H]+=214.099 9 Da)为模板(template),MDF的阈值为±50 mDa。然后,根据氯丙那林可能代谢途径的精确质量变化,进行离子色谱峰提取(EIC),筛查可能的代谢产物。其中,在EIC处理中,保留时间和精确质量的误差分别为±0.05 min和±10 mDa。最后,根据MSE采集的MS/MS信息,对比代谢产物和原形的主要碎片离子,对代谢产物的结 构进行鉴定。

1.5 相对含量计算

由于无法得到所有代谢物的对照品,因此,只能根据EIC的峰面积估算氯丙那林原形或代谢物的相对含量。具体计算公式如下:氯丙那林或代谢物相对含量=峰面积CLO或代谢物/(峰面积CLO+峰面积CLO_M1+……+峰面积CLO_M9)×100% 。

2 结果与讨论
2.1 氯丙那林的质谱裂解特征

根据UPLC/Q-TOF MS采集的MS/MS信息(见图2),氯丙那林的准分子离子([M+H]+)可以产生4个主要的碎片离子,分别为m/z 196、m/z 154、m/z 118和m/z 91,其元素组成、精确质量数(exact mass,EM)和不饱和度(double bond equivalent,DBE)分别见表1。

图2 氯丙那林的MS/MS图 Fig.2 MS/MS spectrum of clorprenaline

表1 氯丙那林的[M+H]+及其主要碎片离子的元素组成、EM理论值及测量值、不饱和度(DBEs)和质量偏差 Table 1 Element compositions,exact masses,DBEs and mass errors of [M+H]+and fragment ions of clorprenaline

根据以上碎片离子信息,可以推测氯丙那林可能的质谱裂解途径(见图3):首先,准分子离子峰([M+H]+,m/z 214)容易失去一个H2O生成碎片离子m/z 196(C11H15NCl+)。随后,N-取代异丙基断裂后,失去C3H6生成碎片离子m/z 154(C8H9NCl+)。而m/z 154失去HCl生成m/z 118(C8H8N+),最后侧链的苯乙烯键断裂生成碎片离子m/z 91(C7H+7)。其中,m/z 154含有稳定的苯乙烯胺结构,是强度最高的碎片离子。以上碎裂离子信息和裂解途径,将为氯丙那林代谢产物的结构鉴定提供重要参考。

图3 氯丙那林的质谱碎裂途径 Fig.3 Proposed fragmentation pathways of clorprenaline
2.2 代谢产物鉴定

除氯丙那林原型外,在猪尿液中还检测到9种主要代谢产物,其中,Ⅰ相代谢产物2种,Ⅱ相代谢产物7种。氯丙那林及其代谢产物的UPLC保留时间(RT)、精确质量数、元素组成和相对含量等见表2。另外,9种代谢产物(CLO_M1～ CLO_M9)的EICs谱图和MS/MS谱图分别见图4和图5。

表2 猪尿样品中氯丙那林及其代谢产物的色谱-质谱信息、代谢途径和相对含量 Table 2 LC-MS information,biotransformation pathways and relative contents of clorprenaline and its metabolites in swine urine

图4 猪尿中氯丙那林代谢产物(CLO_M1～CLO_M9)的EIC图 Fig.4 EICs of clorprenaline metabolites (CLO_M1-CLO_M9) in swine urine

图5 氯丙那林代谢产物(CLO_M1～CLO_M9)的MS/MS图 Fig.5 MS/MS spectra of clorprenaline metabolites (CLO_M1-CLO_M9)
2.2.1 Ⅰ相代谢产物

代谢物CLO_M1(m/z 230.094 5,RT=3.66 min)与CLO_M2(m/z 230.095 6,RT=4.09 min)的[M+H]+的元素组成都为C11H17NO2Cl(EM理论值为 230.094 8 Da),比氯丙那林(C11H17NOCl)多一个氧原子。MS/MS图(图5)显示,M1和M2具有相同的碎片离子m/z 212、m/z 170和m/z 134,比氯丙那林的特征碎片离子m/z 196、m/z 154和m/z 118大16 Da,说明CLO_M1和CLO_M2是氯丙那林的氧化产物。另外,碎片离子m/z 170(C8H9NOCl)和m/z 134(C8H8NO)的存在,说明氧化代谢反应发生在苯环上,而不是侧链的N-异丙基上。因此,CLO_M1和CLO_M2被确定为氯丙那林的苯环羟基化代谢产物(OH-CLO),可能的质谱裂解途径见图6。

图6 OH-CLO可能的质谱裂解过程 Fig.6 Proposed fragmentation pathways of OH-CLO
2.2.2 Ⅱ相代谢产物

代谢物CLO_M3(m/z 390.131 2,RT=4.05 min)和CLO_M4(m/z 390.130 5,RT=4.24 min)的[M+H]+的元素组成为C17H25NO7Cl(EM
理论值为 390.132 0 Da),比氯丙那林多C6H8O6(EM理论值为 176.032 1 Da)。同时,CLO_M3和CLO_M4都具有与氯丙那林相同的特征碎片离子m/z 196和m/z 154(见图5),因此,可以确定它们为氯丙那林的葡萄糖醛酸轭合产物(GLU-CLO),可能的轭合反应位点为 β -羟基或脂肪仲胺。

代谢物CLO_M5(m/z 406.126 4,RT=2.71 min)、CLO_M6(m/z 406.127 1,RT=2.75 min)、CLO_M7(m/z 406.124 8,RT=3.35 min)和
CLO_M8(m/z 406.127 1,RT=3.41 min)的[M+H]+的元素组成全部为C17H25NO8Cl(EM理论值为 406.126 9 Da),比OH-CLO(CLO_M1和CLO_M2)多C6H8O6(EM理论值为 176.032 1 Da)。同时,它们都具有与OH-CLO(CLO_M1和CLO_M2)相同的特征碎片离子m/z 212和m/z 170(见图5)。因此,CLO_M5、CLO_M6、CLO_M7和CLO_M8是OH-CLO的4种葡萄糖醛酸轭合物(GLU-OH-CLO)。

在OH-CLO分子中,β -羟基、脂肪仲胺或酚羟基都可能与葡萄糖醛酸轭合。有研究[8]表明,对于苯环上有羟基的 β -AAs化合物(如莱克多巴胺等),酚羟基比 β -羟基和仲氨基更容易与葡萄糖醛酸发生轭合反应。从图4可以看出,CLO_M8的质谱响应明显大于其他GLU-OH-CLO的同分异构体。因此,可以推测CLO_M8的轭合位点可能在苯环上的羟基上。然而,只根据质谱所采集的碎片离子信息,还无法准确确定轭合反应发生的具体位置。

代谢物CLO_M9(m/z 310.052 0,RT=3.34 min)的[M+H]+对应的元素组成为C11H17NSO5Cl(EM理论值为 310.051 6 Da),比OH-CLO(CLO_M1和CLO_M2)多SO3(EM理论值 79.956 8 Da)。同时,CLO_M9可以失去SO3生成碎片离子m/z 230(C11H17NO2Cl),并具有与OH-CLO相同的特征碎片离子m/z 212和m/z 170(图5)。因此,可以确定CLO_M9为OH-CLO的硫酸轭合产物(SO3-OH-CLO)。另外,在尿液中没有发现氯丙那林的硫酸轭合产物(C11H17NSO4Cl,[M+H]+=294.056 7 Da),说明 β -羟基和脂肪仲胺不易与硫酸轭合。由此可以推测,CLO_M9的硫酸轭合位点在苯环羟基化引入的酚羟基上。

2.3 氯丙那林在猪体内的主要代谢途径

在本研究中,利用UPLC/Q-TOF MS在猪尿中检测和鉴定了氯丙那林的2种Ⅰ相代谢产物和7种Ⅱ相代谢产物。根据代谢物鉴定结果,推测氯丙那林在猪体内先发生苯环羟基化和葡萄糖醛酸轭合,而羟基化氯丙那林(OH-CLO)还能继续与葡萄糖醛酸和硫酸轭合(见图7)。

图7 氯丙那林在猪体内的主要代谢途径 Fig.7 Proposed metabolic pathways of clorprenaline in swine

本研究的结果表明,与其他 β -AAs化合物相似,氯丙那林在猪体内的主要代谢途径也是氧化和轭合反应。以前的研究显示,苯胺型的克伦特罗在牛和猪体内的氧化代谢主要发生在苯胺上[14,15]。然而,由于苯环上的取代基类型不同,氯丙那林的氧化代谢主要是苯环的羟基化。另外,氯丙那林也能通过 β -羟基和仲氨基与葡萄糖醛酸轭合,但没有发现其硫酸轭合产物。

氯丙那林的羟基化代谢产物(OH-CLO)含有一个酚羟基,结构特点与苯酚型 β -AAs(如莱克多巴胺)相似。本研究发现,OH-CLO的代谢特征与莱克多巴胺相同[8,16],可以生成葡萄糖醛酸轭合物(GLU-OH-CLO)和硫酸轭合产物(SO3-OH-CLO)。另外,OH-CLO及其轭合物(GLU-OH-CLO和SO3-OH-CLO)的相对含量为60.9% ,明显高于氯丙那林原形及其轭合产物(39.1% )。因此,羟基化及轭合反应是氯丙那林在猪体内的主要代谢途径。

3 结论

本文采用UPLC/Q-TOF MS鉴定了猪尿中氯丙那林的9种代谢产物,并推测了氯丙那林在猪体内的主要代谢途径——苯环羟基化、葡萄糖醛酸轭合和硫酸轭合。本研究还发现,羟基化氯丙那林及其轭合物是尿液中的主要代谢产物,这将为确定氯丙那林在动物体内的残留标示物提供科学依据。

参考文献
[1]Williams P E, Pagliani L, Innes G M, et al. Brit J Nutr, 1987, 57: 417  
[2]Bergen W G, Johnson S E, Skjaerlund D M, et al. J Anim Sci, 1989, 67: 2255   
[3]Chikhou F H, Moloney A P, Allen P, et al. J Anim Sci, 1993, 71: 906   
[4] Council Directive 96/22/EC
[5]Announcement of the Ministry of Agriculture No. 176 of P. R. China (中华人民共和国农业部公告第176号), 2002
[6]Cao Y, Huang S X, Li D N. Chinese Journal of Veterinary Drug (曹莹, 黄士新, 李丹妮. 中国兽药杂志), 2007, 41 (12): 30
[7]Announcement of the Ministry of Agriculture No. 1519 of P. R. China (中华人民共和国农业部公告第1519号), 2010
[8]Smith D J. J Anim Sci, 1998, 76(1): 173
[9]Miao H, Zou J H, Fan S, et al. Chinese Journal of Chromatography (苗虹, 邹建宏, 范赛, 等. 色谱), 2010, 28(6): 572  
[10]Cai Q R, Wu J S, Qian Z J, et al. Chinese Journal of Chromatography (蔡勤仁, 吴洁珊, 钱振杰, 等. 色谱), 2013, 31(3): 200  
[11]Li D, Sun L, Bi Y F, et al. Chinese Journal of Veterinary Drug (李丹, 孙雷, 毕言锋, 等. 中国兽药杂志), 2013, 47(12): 50
[12]Nie J R, Zhu M L, Lian J, et al. Chinese Journal of Chromatography (聂建荣, 朱铭立, 连槿, 等. 色谱), 2010, 28(8): 759  
[13]Zou Y D, Ren T T, Wu Y B, et al. Journal of Analytical Science (邹永德, 任甜甜, 吴银宝, 等. 分析科学学报), 2014, 30(1): 119  
[14]Zalko D, Bories G, Tulliez J. J Agric Food Chem, 1998, 46(5): 1935  
[15]Zalko D, Debrauwer L, Bories G, et al. Chem Res Toxicol, 1997, 10(2): 197  
[16]Smith D J, Feil V J, Paulson G D. Xenobiotica, 2000, 30(4): 427