介绍了最近色谱研究的几个值得注意的重要进展,包括UPLC高压下蛋白质的构象变化、HPLC流动相统一pH标尺的实验应用、超细粒径UPLC中的滑移流研究、多维色谱-质谱联用的LC-GC×GC-MS/MS和毛细管离子色谱-CE-MS方法、非水硅胶固定相中产生甲硅醚的证据以及用于实时呼气分析的新方法。
蛋白质因为压力产生去折叠现象,其保留会随压力的上升而增大。美国Merck实验室的Makarov等[1]在UPLC柱与检测器之间加一个可调节的背压阀,在选定的流速与稳定条件下使用UPLC-MS,通过氢-氘交换研究了超高压力对蛋白质二级结构(去折叠)的影响。作者使用重水在45 ℃下孵育2 h使蛋白质样品实现充分的氘交换,以普通水溶解的蛋白质样品作为对照,根据含重水流动相和不含重水流动相UPLC等度分离的结果,加上MS检测样品相对分子质量的差异(即氘交换的质量差 Δ H)来评价压力对蛋白质中易于发生氘交换的活泼氢数量。结果显示,压力对存在 α -螺旋的胰岛素、细胞色素C、肌红蛋白样品的影响明显,其处于疏水内区不易交换的氢的数量随压力增大而逐渐减少,而对不存在 α -螺旋的血管舒缓激肽没有变化。升高温度到75 ℃可使胰岛素和细胞色素C均完全去折叠失去疏水内区而实现全部交换。实验中还观察到从不同来源获得的两个牛胰岛素批次之间蛋白质折叠的微小差异。该文利用UPLC的压力结合氘交换差异的质谱检测,使UPLC-MS成为研究蛋白质折叠的方便工具,并可用于区分高级结构差异的蛋白质组分。McCalley[2]最近总结了UPLC实验中压力和摩擦热对保留、选择性、柱效影响的理论与实验研究进展。通常压力会增加样品在反相HPLC中的保留,而且随着分子增大,这种增大的幅度会更大。
如何比较HPLC中含有不同有机溶剂流动相的pH一直是一个棘手的问题,德国Krossing I实验室曾以105 Pa (1 bar)气相质子绝对化学势为基准通过理论推算提出统一的绝对pH(pHabs)标尺,理论上通过测定浸入两溶液中pH电极的电位差可以直接比较两溶液中溶剂化质子的活度,但因为液接电势的测定误差而难以用于实际的实验中。最近,其合作者爱沙尼亚的Leito I实验室再次与其合作[3],借助Izutsu K对液接电位复杂的三分量计算方法,将其引入实际实验并得到一些常用甲醇和乙腈体系流动相的pHabs值(参比为气相)或pHH2Oabs值(参比为水溶液),这些结果可用于直接比较不同有机相和缓冲液之类的流动相的酸性。对于通常HPLC中的流动相,根据流动相中除去有机相后测定的pH(wwpH)与pHH2Oabs之间的单调变化的关系,可用内插法通过测定wwpH得到其pHH2Oabs值。用pHH2Oabs还可能更好地描述流动相中弱酸和弱碱的离解行为。该结果将对HPLC和非水CE中pH影响的理论研究提供重要帮助。
亚2 μ m UPLC及核-壳颗粒固定相的高速高效分离能力已被广泛用于小分子分离分析。由于大分子扩散系数小,传质阻力大,在蛋白质分离方面仍有待改进。由于“滑移流”的存在,使用更小的亚微米颗粒在蛋白质分离方面可以获得出乎意料的结果。美国普渡大学的Wirth M J实验室在亚微米与滑移流研究中取得了很多值得注意的结果。最近他们发表的“Feature”文章[4]详细介绍了这方面的进展。普通色谱区带的抛物线流型源于流动相在固定相边界的零流速,但当流动相与固定相间的相互作用弱于流动相分子之间的相互作用且孔径较小时,在固定相界面会存在非零的“滑移流”。实验结果不但显示柱压因为这种滑移流的存在而降低,而且柱效也比预期好得多。他们使用0.47 μ m反相硅胶填装的毛细管LC分离荧光标记牛血清白蛋白(BSA)组分最高获得过0.015 μ m的塔板高度。这使蛋白质组分的分离度和检测灵敏度都获得了很大改善。去年他们[5]使用0.47 μ m C18键合固定相获得10倍的滑移流,经nano-ESI实现与质谱联用,在高效分离和高重复性的同时获得了高柱容量。
对于复杂样品的全分析,多维分离是有吸引力的研究方向。意大利Mondello L实验室[6]最近发表了在线LC-GC×GC-MS/MS方法,这被他们看成是一种五维方法(将三重四极杆质谱看成二维的质谱分离)。他们以煤焦油的二氯甲烷溶液为样品,先用LC分离(100 mm×3 mm×5 μ m硅胶柱,以正己烷-二氯甲烷流动相梯度洗脱,二极管阵列检测),将样品分为非芳香烃、不饱和化合物、含氧化合物3组,并除去相对分子质量太大的成分。再以该实验室已有的配有特制双侧端口进样针的AOC-5000自动进样器作为LC与GC之间的接口,通过这个改进的25 μL进样针将LC馏分从检测器出口转移到GC×GC-MS/MS系统(由两台GC2010气相色谱与一台TQ8030三重四极杆质谱组成)。其中第一台GC配备具有程序升温功能的进样器和SLB-5ms柱(30 m×0.25 mm×0.25 μ m),通过一段空毛细管(1.5 m×0.18 mm),用环形低温调制器每5 s以300 ℃持续300 ms的热脉冲调制进样到第二台GC中的短GC柱(Supelcowax-10,1.0 m×0.10 mm×0.10 μ m)中。结果MS谱图中的干扰因LC的分离而明显减少,从C11到C28的直链、支链和环状的非芳香烃都得到满意的识别,大多数含氧和不饱和化合物的质谱谱图相似度可以达到90%以上。利用100 ppb含硫标样的质谱图,通过MRM检测,分类识别了煤焦油中的大量含硫化合物。
对于复杂离子化合物样品的多维分离,最近德国的Matysik F-M小组[7]建立了用于离子分离的毛细管IC-CE-MS联用方法。毛细管离子色谱使用ICS-5000离子色谱仪(配有电导检测器),以Dionex Ion-Swift MAX-200毛细管离子色谱柱(0.25 mm×250 mm)和40 mmol/L 的KOH水溶液流动相(流速5 μ L/min)分离核苷酸和环核苷酸6种混合阴离子。离子色谱流出液连续流过一根转移毛细管(内径75 μ m,长60 cm),使用该实验室已有的批式进样接口改进后作为调制器,通过上下移动转移毛细管口,在上部30～50 μ m处对准分离毛细管(内径25 μ m,长20.5 cm)的进样口,实现连续的第二维在线毛细管电泳进样(选择每间隔15 s进样2 s)。以25 mmol/L 的醋酸铵缓冲液(用氨水调到pH 9.15)为毛细管电泳分离缓冲液,在22.5 kV下电泳分离。以同轴鞘流电喷雾接口与micrOTOF-MS质谱在线连接检测，实现了对这些离子的IC-CE-MS完全分离和检测。对比实验表明,单用其中的一种分离条件没有分开这些组分。由于离子色谱有柱后抑制器,其流出液的电导很低,他们通过实验证实毛细管电泳中存在区带堆积效应。
美国Waters公司的Fairchild等[8]以3-苯甲酰吡啶和黄酮(flavone)为样品,用耐碱的杂化硅胶柱(BEH)在超临界流体色谱(SFC)标准实验条件(流动相为CO2-甲醇(90 ∶ 10),柱温40 ℃,背压调节器压力 2 175 psi)下分不开两组分,但在柱中存在甲醇(且没有水)的情况下两峰会随着色谱柱放置时间延长逐渐分开。固体NMR显示固定相表面存在键合的甲氧基,证实柱中的硅醇基逐渐转换成甲硅醚。而使用含水流动相冲洗可以将其较快地还原为硅醇状态。0.1%的N,N-二甲基丁胺可以双向催化这个可逆反应。异丙醇也存在类似的反应但速度很慢。通过实验证实SFC中保留时间和选择性随时间而变化的一个主要原因是甲硅醚的形成。甲硅醚由固定相表面的硅醇基与溶剂中的醇反应产生。在SFC中,由于固定相表面形成甲硅醚,降低了亲水性,可观察到保留和选择性的改变。甲硅醚的形成存在可逆平衡,在水中可以水解而再生。甲硅醚可能会出现在包括HPLC柱的任何含硅醇基的色谱填料中,但流动相中含有5%的水就会显著减弱甲硅醚的产生。色谱柱的储存条件对甲硅醚的形成也有很大影响。
近年来,实时呼气分析作为一种非侵入性的方法已用于疾病诊断及呼出气分子指纹谱分析。最常用的呼气分析技术是GC-MS,但它难以用于实时样品分析和非挥发成分的分析。德国Zimmermann R实验室[9]发展了一种实时快速检测呼出气中气体有机物的直接MS分析方法。他们使用商品化的针阱式采样器(needle trap device,NTD)采集呼出气,与热脱附光电离飞行时间质谱(TD-PI-TOFMS)结合。质谱仪经去活石英毛细管连接到一个气相色谱进样器。收集在NTD中的分析物在进样器中热解吸(TD)并转移到PI-TOFMS分析。整个TD-PI-TOFMS过程只需10 s。用单光子离子化(SPI)离子源在呼气中可以检测到丙酮、乙醛、异戊二烯、半胱胺等较小的有机物,而共振增强多光子离子源(REMPI)可以识别芳香族物质酚和吲哚。吸烟者呼气中的几种外源性物质如苯、甲苯、苯乙烯、乙基苯也可以被检测到。该方法还用于分析麻醉实验动物(猪)呼出气体中的麻醉剂丙泊酚。也可以将去活毛细管换成毛细管气相色谱柱,在失去速度优势的情况下获得NTD-TD-GC-PI-TOFMS更好的选择性和准确度。
瑞士苏黎世联邦高等工学院的Zenobi R小组[10]则用反相UPLC与高分辨线性离子阱(LTQ)-轨道阱质谱联用分析自制低温冷阱收集的健康受试者呼出气冷凝液,通过保留时间、串联质谱的裂解关系以及与标样的比较,从中鉴别出3类作为脂质过氧化重要标记物的中低挥发性醛类化合物。然后,单独使用同一质谱,配备低流量二次电喷雾离子源(LF-SESI),使呼气通过加热管直接进入MS,实现了更适于临床诊断的在线实时分析,部分组分还得到了二级MS谱图。
2015, Vol. 33 Issue (4): 331-333
PDF (767 KB)
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