植物中天然的细胞分裂素(cytokinins, CKs)是一类具有腺嘌呤环结构的植物激素,对细胞生长、分化和器官形成等具有重要的调控作用[1, 2]。水稻是我国的主要粮食作物,近年来有关水稻中CKs与抗逆性、产量及稻米品质等关系的研究备受关注,并取得了一些重要研究成果[3, 4]。现已发现的CKs有40余种[5],但其在水稻体内的生理功能、生物代谢及分子调控机理等尚未完全阐明[6, 7]。在我国,由于痕量植物激素分析技术的相对滞后,对CKs间的转化关系了解甚少[8],严重阻碍了相关研究的进展。而建立水稻中多种CKs的定性、定量分析方法,将为此提供重要的技术手段。
由于植株体内CKs含量极低,通常不超过30 pmol/g(以鲜样重计)[9],且植物基质异常复杂,要实现对其准确定量,选择有效的样品纯化方法及灵敏度高、选择性强的检测手段则至为关键。目前针对CKs的纯化方法主要有液液萃取[10, 11]、分散固相萃取[12]、固相萃取[13]等。其中,液液萃取和分散固相萃取法虽条件温和、过程简单,但实验表明其仅适合于极少数CKs的纯化。反相C18柱[14]、亲水亲油平衡(HLB)柱[15]、混合型阴离子交换反相柱(Oasis MAX)[16]以及多种填料联用[17]等固相萃取技术尽管使用最为广泛。但反相填料除杂能力有限,当样品中富含非极性杂质时,常产生较强的背景干扰或基质效应[13];而阴离子交换柱对碱性较强的CKs吸附能力较差,导致目标物损失严重;联用技术虽克服了上述不足,但使用过程中涉及若干淋洗、洗脱等步骤,方法的重现性差。近年来,一些特殊萃取技术,如Fe3O4纳米粒子吸附剂[2]、共聚物固相微萃取[18]和分子印迹富集柱[19]等纯化材料也有应用,但受商品化等因素限制,目前还难以推广使用。
针对CKs的弱极性和弱碱性的特点[13],本文采用混合型磺酸阳离子交换树脂(PCX),在酸性条件下,使带正电荷的目标化合物在离子交换和反相吸附的双重作用下被富集和纯化,再结合液相色谱-串联质谱(LC-MS/MS)的高灵敏度、高选择性检测,实现了水稻中17种CKs的同时定性、定量分析。方法操作简单,纯化效果好,分析结果准确、可靠。
Survryor系列液相色谱仪、TSQ Quantum Access Max三重四极杆质谱仪附电喷雾离子源、台式冷冻离心机Biofuge Primo R(美国Thermo Fisher公司)。
乙腈、甲醇(色谱纯,德国Merck公司);甲酸(色谱纯)、二甲基亚砜(DMSO,色谱纯)、甲酸铵(分析纯)、氨水(28% ～30% )和氢氧化钠均购自美国Sigma-Aldrich公司;Bond Elut Plexa PCX(60 mg×3 mL,美国Agilent Technologies公司);实验用水为Milli-Q超纯水。
17种CKs标准品:异戊烯基腺嘌呤(iP)、异戊烯基腺嘌呤核苷(iPR)、7- β -葡糖基-N6-(异戊二烯基)腺嘌呤(iP7G)、9- β -葡糖基-N6-(异戊二烯基)腺嘌呤(iP9G)、反式-玉米素(tZ)、反式-玉米素核苷(tZR)、反式-7- β -葡糖基玉米素(tZ7G)、反式-9- β -葡糖基玉米素(tZ9G)、反式-O- β -葡糖基玉米素(tZOG)、反式-O- β -葡糖基-9-核糖基玉米素(tZROG)、顺式-玉米素(cZ)、顺式-玉米素核苷(cZR)、二氢玉米素(DZ)、7- β -葡糖基二氢玉米素(DZ7G)、9- β -葡糖基二氢玉米素(DZ9G)、O- β -葡糖基二氢玉米素(DZOG)和O- β -葡糖基-9-核糖基二氢玉米素(DZROG)均购自捷克Olchemim公司,纯度均≥95% 。
准确称取上述CKs标准品,配成200 μ g/mL 的单标准储备液。依据各自溶解性,其中iP、tZ用甲醇配制,cZ、cZR、DZ7G、DZ9G和tZROG用80%(体积比,下同)乙醇配制,tZOG、DZOG和DZROG用60%甲醇配制,iP7G、tZ7G和iP9G用DMSO配制,tZ9G、DZ、iPR和tZR先用少量0.1 mol/L 的氢氧化钠溶解,再用甲醇定容。用甲醇将储备液稀释为1 μ g/mL 的单标准溶液,用于质谱条件优化;各取0.5 mL单标准储备液,用甲醇定容至100 mL,配成1 μ g/mL 的17种CKs混合标准溶液。各标准溶液均置于-40 ℃。
取新鲜的水稻植株,按根、茎和叶等部位分割,剪碎,于研钵中加液氮磨细。分别称取0.2 g(精确至0.001 g)样品于10 mL塑料离心管中,加入2 mL预冷(4 ℃)的80%甲醇溶液,在4 ℃下浸提16 h,其间振摇2～3次。取出后于4 ℃在8 000 r/min 的转速下离心10 min,收集上清液。残渣中加入2 mL 80%甲醇,漩涡振荡,于4 ℃在8 000 r/min 的转速下离心10 min,将两次提取液合并,加入50 μ L甲酸,混匀,获得样品粗提液。
PCX固相萃取柱用2 mL甲醇活化,再用2 mL 1%甲酸平衡,将样品粗提液全部过PCX固相萃取柱。依次用2 mL 0.1%甲酸和2 mL甲醇淋洗萃取柱。用2 mL 0.5%氨水-甲醇溶液洗脱,重复一次。2次洗脱液均收集于10 mL试管中,于35 ℃氮吹至体积约为0.1 mL,加水稀释至0.5 mL,混匀,过0.22 μ m滤膜后待测。
分析柱:ZORBAX Extend-C18(100 mm×2.1 mm, 1.8 μ m);柱温:40 ℃;进样量:5 μ L。流动相A: 5 mmol/L 甲酸铵溶液;流动相B:甲醇;流速:150 μ L/min;梯度洗脱程序:0～30 min, 10% B～45%B; 30～35 min, 45% B～95%B; 35～35.1 min, 95% B～10%B; 35.1～55 min, 10%B。
电喷雾电离正离子模式(ESI+);喷雾电压:3 kV;离子源温度:350 ℃;鞘气压力:241 kPa;辅助气流量:1.5 mL/min;碰撞气(Ar)压力:0.2 Pa;离子传输管温度:300 ℃。采用选择反应监测(SRM)模式扫描;其他参数见表1。
目前对多种CKs同时提取的方法主要有异丙醇-水-浓盐酸(2 ∶ 1 ∶ 4, v/v/v)结合二氯甲烷萃取法[11]、甲醇-水(80 ∶ 20, v/v)溶液提取法[14]以及甲醇-甲酸-水(15 ∶ 1 ∶ 4, v/v/v)浸提法[16]等。本文通过基质加标方法考察了上述3种提取溶剂对水稻叶片中17种CKs的提取效率。其中异丙醇-水-浓盐酸结合二氯甲烷萃取法按Pan等[11]的方法进行,甲醇-水溶液提取法按1.4.1节提取步骤操作，甲醇-甲酸-水浸提法参照Wang等[16]的方法进行。分别向0.2 g样品中加入20 μ L混合标准溶液(1 μ g/mL),采用以上3种方法进行提取，各组提取液均采用基质匹配校准法测定。结果表明:甲醇-水溶液对17种目标化合物的提取效率最高,为80.1% ～101.7% ;甲醇-甲酸-水溶液略低,为78.4% ～95.8% ;而异丙醇-水-浓盐酸结合二氯甲烷对大多目标化合物的提取效率均不到30% , tZR、tZ7G、tZ9G、tZROG、DZ7G、DZ9G和DZOG这7种CKs未能被检测到。其原因可能是在强酸介质中,碱性激素呈离子状态(带正电荷)而未被分配到弱极性的二氯甲烷层。同样地,通过对水稻根、茎的提取试验,也得到与上述类似的研究结果,因此本文选择甲醇-水溶液为提取溶剂。
PCX萃取树脂为混合型材料,对极性碱性化合物具有良好的吸附作用。在酸性条件下上样,呈阳离子形态的CKs与萃取柱填料上的磺酸基团发生相互作用而被吸附。依次用水、甲醇淋洗以去除弱酸性和中性化合物杂质,再加入氨化甲醇,使填料环境呈碱性,此时目标物呈中性而被甲醇洗脱。
用基质效应强弱来评价方法的纯化效果。分别以1.4.1节方法处理得到的样品粗提液、1.4.2节方法处理得到的样品纯化后溶液和20%甲醇溶液配制17种CKs的混合标准溶液。各目标化合物的质量浓度均设为0.1、0.5、5和25 ng/mL。经LC-MS/MS测定,用目标化合物定量离子的峰面积对标准溶液质量浓度绘制标准曲线。以前两组样品获得的曲线斜率分别与后一组样品获得的曲线斜率比值 η 的大小来判定基质效应的强弱[20]。 η 值越接近1,基质效应越弱,即方法纯化效果越好; η 值偏离1越大,基质效应越强。结果表明,与水稻根和茎相比,水稻叶样品的基质效应最强。图1为以水稻叶基质为例,PCX固相萃取柱对样品的纯化效果。由图1可知,当样品未经纯化时,17种CKs均表现出较强的基质效应,其中绝大多数CKs的 η 值均小于0.70,而DZ7G的 η 值高达1.24。当样品粗提液经PCX固相萃取柱纯化后,尽管粗提液被浓缩近8倍,但各目标化合物的基质效应仍明显减弱,其 η 值均在0.79～1.07之间。由此可见,本文选用PCX固相萃取柱具有较好的纯化效果,提高了方法的准确度。
多数CKs结构较为相似,有些还互为同分异构体,含有相同的碎片离子,如tZ7G、tZ9G和tZOG, DZ7G、DZ9G和DZOG等(见表1)。要对这些目标化合物进行准确定量,选择良好的色谱分离条件是关键。为此,本文在采用1.8 μ m超高效C18分析柱的基础上,对流动相组成进行了优化。通常情况下，向流动相中添加甲酸或缓冲盐(通常为甲酸铵)可获得更高的ESI+分析灵敏度。但试验结果表明,当流动相中添加甲酸时,上述同分异构体分离度变差,且甲酸浓度越高,分离效果越差。可能是CKs在酸性条件下易带正电荷,导致其在反相C18柱上保留变弱所致。而当添加甲酸铵时,本文中所有的同分异构体均得到基线分离。综合考虑分离效率和质谱耐受性,本文最终选用5 mmol/L 甲酸铵-甲醇为流动相。在最佳条件下,17种CKs的SRM色谱图见图2。
以蠕动泵进样方式将17种CKs标准溶液(1 μ g/mL)分别注入质谱系统,结果表明,所有分析物均在正离子模式下获得最佳灵敏度,且主要形成[M+H]+准分子离子峰。通过二级质谱优化,得到了17种CKs的最佳SRM采集参数(见表1),其中离子反应通道1为定量离子,通道2为定性离子。
将1.3节中1 μ g/mL 的混合标准溶液用20%甲醇配制成系列浓度的混合标准工作液,按照1.5节条件进行测定,每个浓度测定3次。以目标化合物定量离子的峰面积平均值(y)对标准溶液质量浓度(x, ng/mL)进行线性回归分析,得到17种CKs的线性方程和相关系数(r)(见表2)。结果显示, 各目标化合物均在0.01～100 ng/mL 范围内呈良好的线性关系,r均大于 0.9984。
在水稻样品中添加不同浓度的待测物,按本方法进行检测,以信噪比S/N=3确定各目标化合物的检出限(LOD),由表2可知,17种目标化合物的检出限在0.01～0.05 ng/g之间。
取水稻根、茎和叶样品,分别添加0.2、1和5 ng/g 3个浓度水平的17种目标化合物,每个水平重复测定6次,平均回收率和精密度见表3。可以看出,各目标化合物在3个加标水平下,平均回收率为60.2% ～125.4% ,RSD为5.4% ～29.7% 。
按本方法对水稻3个部位的17种CKs含量进行了分析,每个部位样品重复测定3次,取平均值,具体分析结果见表4。可以看出,水稻根和叶中均有5种CKs(tZ9G、cZ、iP9G、cZR和iPR)检出,而茎中只有4种CKs(tZ9G、cZ、iP9G和cZR)检出。所有检出的CKs含量在0.02～0.93 ng/g范围内,这与之前文献报道的结果[21]相似。
本文建立了液相色谱-串联质谱测定水稻样品中17种CKs的分析方法,该方法灵敏度高、选择性强。采用甲醇-水溶液提取、混合型阳离子交换反相树脂纯化,实现了水稻基质中各分析物的高效提取,同时有效降低了基质效应。采用小粒径(1.8 μ m)超高效C18分析柱,优化了流动相条件,实现了多种同分异构体的基线分离和准确定量。结果表明,该方法能满足水稻中17种CKs的分析。
2015, Vol. 33 Issue (7): 715-721
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