Agilent 1200型高效液相色谱仪,配多波长检测器、真空脱气机和Chemstation工作站(美国Agilent公司);电子分析天平(ALC-310型,上海民桥科学仪器有限公司);超声波清洗器(KQ2200E,昆山超声仪器有限公司);高速离心机(Allegre 64R,美国贝克曼公司);纯水净化仪(Milli-Q,法国Millipore公司); Eclipse XDB-C18柱(150 mm×4.6 mm,3.5 μ m;美国Agilent公司);移液枪(Finnpipetter F3,赛默飞世尔科技公司);微量注射器(美国Agilent公司);针式有机相滤膜(0.22 μ m,天津兰博仪器有限公司)

乙腈、甲醇(色谱纯,美国Fisher公司);磷酸、乙醇和氯化钠(分析纯,北京化学试剂厂);实验用超纯水由Milli-Q水处理系统制得。

离子液体1-丁基-3-甲基咪唑四氟硼酸盐([BMIM] [BF₄],纯度＞99% )、1-己基-3-甲基咪唑四氟硼酸盐([HMIM] [BF₄],纯度＞99% )、1-丁基-3-甲基咪唑六氟磷酸盐([BMIM] [PF₆],纯度＞98% )、1-己基-3-甲基咪唑六氟磷酸盐([HMIM][PF₆],纯度＞97% )和1-辛基-3-甲基咪唑六氟磷酸盐([OMIM] [PF₆],纯度＞99% )以及六氟磷酸铵(NH₄PF₆,98% )购于上海成捷化学试剂公司。

三嗪类除草剂草净津、敌草净、特丁通、特丁津和异戊乙净标准品,纯度均大于99% ,购于中国药品生物制品检定所(北京)。

4种不同的婴儿配方奶粉购于超市,这些样品包括适用0～6个月的婴儿配方奶粉(样品1)、6～12个月的婴儿配方奶粉(样品2)、12～24个月的婴儿配方奶粉(样品3)和24～36个月的婴儿配方奶粉(样品4)。

准确称取适量三嗪类除草剂标准品,用甲醇溶解配制500 mg/L 单标准储备液,于4 ℃下保存。分别移取单标准储备液用甲醇配制成10 mg/L 的混合标准溶液;根据实验要求稀释成0.5～10 mg/L 的混合标准工作溶液,现用现配。

准确称取 2.000 0 g的婴儿配方奶粉,溶解于20.00 mL 60 ℃的超纯水中,振荡15 min,保证固体奶粉完全溶解并混合均匀;取5.00 mL混合后的样品溶液放入10 mL的聚四氟乙烯离心管中,加入0.20 g NaCl,用0.1 mol/L 磷酸溶液调节pH值为6,在40 ℃下超声振荡10 min,于20 ℃、15 000 r/min 条件下离心10 min,将上清液转移至另一支10 mL聚四氟乙烯萃取管中,依次加入80 μ L [HMIM][PF₆](萃取剂)和80 μ L [HMIM][BF₄](分散剂),将此离心管置于超声波清洗器中于40 ℃下萃取5 min。再加入150 μ L离子对试剂溶液NH₄PF₆,振荡1 min。此时离心管中的溶液形成一个水/分散剂/萃取剂的乳浊液体系,三嗪类除草剂迅速地由水相转移到萃取相(离子液体相)中并且达到两相平衡。平衡后,溶液在室温、15 000 r/min 条件下离心10 min,此时观察到溶液分层,在萃取管底部得到萃取液沉积相。完全移除上层的水相,同时用50 μ L微量注射器将萃取液完全转移到1.0 mL离心管中,再用流动相稀释到200 μ L作为分析溶液,超声2 min,过0.22 μ m滤膜后进行高效液相色谱分析。

色谱柱:Eclipse XDB-C18色谱柱(150 mm×4.6 mm,3.5 μ m;美国Agilent公司);柱温:30 ℃;流动相:乙腈(A)和水(B);流速:1.00 mL/min;梯度洗脱程序:0～5 min,60%B～40%B; 5～15 min,40%B～20%B; 15～20 min,20%B～60%B; 20～30 min,60%B。进样体积:10 μ L,紫外检测波长:228 nm;参比波长:360 nm;狭缝宽度:4 nm。

在奶粉等乳制品中,蛋白质和氨基酸是其中的主要成分,要想获得较好的分析结果,需要将奶粉中的蛋白质和脂肪除去。常用的去除蛋白质和脂肪的方法是在酸性条件下加入有机溶剂使得蛋白质和脂肪变性,但是大量的有机溶剂会造成严重的污染。本实验选择用NaCl在酸性条件下沉淀蛋白质和脂肪。样品溶液中加入NaCl后,蛋白质与水之间的亲水性胶体被破坏,蛋白质分子发生聚集和沉降。一般情况下,pH低于蛋白质等电点时,蛋白质也会发生聚集和沉降。大多数蛋白质的等电点在4.0～6.0之间,所以选择酸性条件下加入无机盐，通过沉淀的方法除去蛋白质和脂肪。

在萃取剂的用量和分散剂的用量均为80 μ L的条件下,考察了NaCl的加入量(0.10、0.15、0.20、0.25、0.30 g)的影响。经过比较待测组分的回收率发现,当NaCl的加入量为0.20 g时,沉淀效果最好,萃取回收率最高(见图1)。这主要是因为当NaCl的加入量较小时,浓度较低,盐析效应起主导作用,目标分析物的溶解度降低使其更易从水相转移到萃取相中;随着NaCl量的增加,萃取率逐渐升高,但当NaCl加入量太大时,水溶液的密度高于离子液体的密度,从而降低了离子液体相的回收率;另一方面萃取剂[HMIM][PF₆]中的阴离子[PF₆]^-易与溶液中的Cl^-发生离子交换,导致水溶性离子液体[HMIM]Cl的产生,也会降低离子液体的萃取率。故选择NaCl的加入量为0.20 g。

图1

Fig. 1

图1 NaCl用量对三嗪除草剂回收率的影响 Fig.1 Effect of NaCl amount on the recoveries of the triazine herbicides

pH值是影响萃取回收率的主要因素。一方面样品溶液的前处理效果受pH值影响,在酸性条件下,蛋白质更易沉淀,有利于目标分析物的分散萃取;另一方面,三嗪除草剂属于弱碱性物质,调节pH值使其酸化后更有利于三嗪除草剂的萃取。但由于蛋白质的等电点在4～6之间,强酸、强碱条件下不利于萃取,影响富集效果。实验考察了pH值分别为5.0、6.0、7.0、8.0、9.0时对三嗪除草剂回收率的影响。结果表明,随着pH增加,萃取回收率逐渐增加,当pH值为6.0时达到最大,随后趋于平稳。因此所有实验都在pH为6的条件下进行。

图2

Fig. 2

图2 萃取溶剂的类型对三嗪除草剂回收率的影响 Fig.2 Effect of type of extraction solvents on the recoveries of the triazine herbicides

离子液体咪唑阳离子1位上不同烷基取代与离子液体阴离子种类均影响萃取三嗪除草剂的能力。本实验考察了5种咪唑类离子液体[BMIM][BF₄]、[HMIM][BF₄]、[BMIM][PF₆]、[HMIM][PF₆]和[OMIM][PF₆]对回收率的影响(见图2)。当阴离子相同时,离子液体在水中的溶解性随着阳离子烷基链的增长而降低,其非极性特征明显增加,从而对非极性物质的溶解性增强。通过实验发现,亲水性和疏水性离子液体均具有萃取能力,但是疏水性离子液体的萃取回收率明显高于亲水性离子液体。这是因为疏水性离子液体更易于和水相分离,[OMIM][PF₆]作为萃取剂时在色谱图上出现干扰峰。综合考虑,选择[HMIM][PF₆]作为本实验的萃取剂。

实验还考察了萃取剂的用量。当加入80 μ L离子液体时,萃取回收率达到最大值并趋于稳定。

图3

Fig. 3

图3 分散剂的类型对三嗪除草剂回收率的影响 Fig.3 Effect of type of dispersion solvents on the recoveries of the triazine herbicides

分散剂的类型是影响萃取效率的又一重要因素。所选分散剂应能与萃取剂及水有良好的混溶性,而在分相时又能形成两相,并且对目标化合物的测定不产生干扰。本实验选择两种亲水性离子液体[BMIM][BF₄]、[HMIM][BF₄]和3种常用的有机溶剂甲醇、乙醇、乙腈进行考察。从图3可见,甲醇和乙醇作为分散剂时萃取回收率都比较低，并且实验结果不稳定，在实验过程中发现用甲醇作分散剂时溶液
出现明显的乳化现象,萃取相不易分离出来;乙醇和甲醇类似;用乙腈、[BMIM][BF₄]和[HMIM][BF₄]回收率结果都比较满意，但乙腈毒性高于其余二者；亲水性离子液体与水和萃取剂(疏水性离子液体)都有较好的溶解能力，能够增大各相之间的接触面积，有利于萃取分离。用[BMIM][BF₄]获得的分析物回收率略高于用乙腈和[HMIM][BF₄]。基于上述理由,选择[BMIM][BF₄]作为分散剂,用量为80 μ L。

实验考察了萃取时间分别为4、5、6、7和8 min对回收率的影响。结果发现,萃取时间为5 min时萃取回收率达到较大值,再增加萃取时间4种除草剂的回收率有所下降。这可能是因为选择两种阳离子相同的离子液体作为萃取剂和分散剂使得萃取剂和水溶液的接触面积增大,而超声可促进萃取相与水相的接触和混合,加速不互溶两相之间的质量传递,使得萃取效率在最小的萃取剂使用量和最短的时间内得到快速的提高,在此情况下,三嗪除草剂可以在两相间迅速转移。超声时间过长会产生热量,可能增加溶液的挥发度而影响萃取效果。如图4所示,选择5 min为最佳萃取时间。

图4

Fig. 4

图4 萃取时间对三嗪除草剂回收率的影响 Fig.4 Effect of extraction time on the recoveries of the triazine herbicides

萃取温度对萃取过程有着显著的影响。考察了在功率固定为80 W时,不同温度(25～45 ℃)下萃取回收率的变化情况。结果表明,随着温度从25 ℃升到40 ℃,回收率逐渐增加,之后回收率缓慢下降。这是因为随着温度升高,溶液中粒子间的相互运动更剧烈,移动的速度更快,温度到达一定值时萃取达到平衡,回收率稳定；继续升高温度，萃取能力不再继续增加。因此选择40 ℃为最佳萃取温度。

在最佳的实验条件下,从加标奶粉样品中萃取5种三嗪除草剂并进行HPLC测定,通过峰面积(A)与加标样品中三嗪除草剂的含量(C， μ g/kg)制作工作曲线,结果见表1。通过工作曲线计算方法的检出限(LOD)和定量限(LOQ)。LOD和LOQ均由下式计算:LOD=3 σ /k,LOQ=10 σ /k,其中 σ 是将11个空白样品直接进样进行HPLC分析得到的信号的标准偏差,k是工作曲线的斜率。

表1

Table 1

表1(Table 1)

表1 5种三嗪除草剂的线性方程、相关系数、线性范围、检出限和定量限 Table 1 Regression equations,correlation coefficients,linear ranges,limits of detection (LODs) and limits of quantification (LOQs) of the five triazine herbicides Herbicide Regression equation Correlation coefficient Linear range/(μg/kg) LOD/(μg/kg) LOQ/(μg/kg) RSD/% Cyanazine A=0.5198C+40.506 0.9992 40.00-12500.00 18.06 60.22 3.13 Desmetryn A=0.8975C+120.27 0.9994 40.00-12500.00 12.17 40.56 3.64 Terbumeton A=0.6434C+62.95 0.9996 40.00-12500.00 18.74 62.48 4.02 Terbuthylazine A=0.7946C+140.39 0.9992 40.00-12500.00 15.74 52.48 4.17 Dimethametryn A=0.7621C+113.55 0.9995 40.00-12500.00 14.52 48.42 3.69 A: peak area; C: content of the analyte,μ g/kg.

表1 5种三嗪除草剂的线性方程、相关系数、线性范围、检出限和定量限 Table 1 Regression equations,correlation coefficients,linear ranges,limits of detection (LODs) and limits of quantification (LOQs) of the five triazine herbicides

为了评价方法的准确性和精密性,制备3个加标水平(10.00、50.00和100.00 μ g/kg)的加标样品,日内精密度通过1天之内平行分析3次加标样品所得到回收率的RSD表示。日间精密度通过每天分析1次加标样品,连续分析3天所得回收率的RSD表示。由表2可见5种三嗪类除草剂的回收率为92.2% ～103.2%,日内及日间RSD均低于6% 。

表2

Table 2

表2(Table 2)

表2 婴儿奶粉中5种待测物在3个加标水平的回收率和精密度 Table 2 Recoveries and RSDs of the five analytes spiked in infant milk powders at three levels Sample No. Herbicide 10 μg/kg 50 μg/kg 100 μg/kg Recovery/ % Intra-day RSD/% Inter-day RSD/% Recovery/ % Intra-day RSD/% Inter-day RSD/% Recovery/ % Intra-day RSD/% Inter-day RSD/% 1 cyanazine 96.2 3.4 4.9 95.3 3.2 4.6 93.8 3.0 3.7 desmetryn 95.8 3.6 5.3 94.0 2.9 3.5 93.9 2.9 3.3 terbumeton 93.8 3.6 4.7 93.2 3.8 3.9 94.6 3.1 4.1 terbuthylazine 96.3 3.7 4.6 94.3 3.7 4.4 94.8 3.2 4.1 dimethametryn 102.5 3.6 4.6 103.1 3.8 4.6 103.2 2.9 3.6 2 cyanazine 92.2 3.9 4.6 95.9 3.2 4.5 94.0 3.1 4.4 desmetryn 95.7 3.4 4.3 93.9 3.6 4.5 95.2 3.2 4.6 terbumeton 93.1 3.5 4.2 95.5 3.4 4.4 94.2 2.6 3.6 terbuthylazine 93.3 3.3 5.1 95.4 3.9 4.8 95.9 2.8 3.6 dimethametryn 100.6 3.6 4.4 102.4 3.7 4.6 101.8 3.0 3.9 3 cyanazine 95.8 3.8 4.3 94.9 3.6 4.9 94.1 3.1 4.3 desmetryn 95.3 4.1 5.6 95.7 3.1 4.2 95.1 3.9 3.8 terbumeton 94.2 3.9 4.6 94.3 2.5 3.7 95.4 2.9 3.7 terbuthylazine 97.3 3.7 4.4 96.4 2.8 3.5 95.6 2.7 3.6 dimethametryn 103.2 3.6 4.8 101.9 3.1 3.9 102.2 2.7 3.5 4 cyanazine 96.3 3.2 5.4 93.9 3.2 4.4 95.2 3.3 3.8 desmetryn 97.4 4.0 4.9 95.6 2.1 2.4 94.7 1.9 2.8 terbumeton 96.8 3.6 4.5 95.1 3.1 4.3 95.0 2.9 3.8 terbuthylazine 95.9 3.5 5.3 94.4 3.8 4.6 94.9 2.8 3.6 dimethametryn 102.7 4.1 4.9 103.0 3.2 4.7 102.6 2.9 3.8

表2 婴儿奶粉中5种待测物在3个加标水平的回收率和精密度 Table 2 Recoveries and RSDs of the five analytes spiked in infant milk powders at three levels

在最佳条件下对4种奶粉样品进行了分析,样品中均未检出待测物。标准溶液、空白样品和加标样品的色谱图见图5。

图5

Fig. 5

图5 (a)标准溶液、(b)空白样品和(c)加标样品的色谱图 Fig.5 Chromatograms of (a) a mixed standard solution,(b) a blank milk powder sample and (c) a spiked sample Peaks: 1. cyanazine; 2. desmetryn; 3. terbumeton; 4. terbuthylazine; 5. dimethametryn.

基于离子液体的超声辅助均相液液微萃取成功应用于萃取分离婴儿奶粉中5种三嗪除草剂,对影响实验结果的条件进行了考察,获得了最佳萃取条件。基于离子液体的超声辅助均相液液微萃取方法操作简便,利用离子液体取代传统萃取剂,使得样品前处理过程更加环保并减少了有机试剂的用量。所建立的离子液体均相液液微萃取-高效液相色谱方 法灵敏度高、操作简单,适用于奶粉样品中三嗪类除 草剂残留的检测。