N⁶-羟苄腺苷(见图1)对照品(纯度大于98% )和N⁶-二羟乙基腺苷由本实验室合成分离得到;6-苄氨基嘌呤和6-氯嘌呤核苷购自大连美仑生物科技有限公司;乙腈、甲醇、乙酸和甲酸皆为色谱纯,购自美国Sigma公司;肝素钠购自美国Sigma公司。实验用水为去离子纯化水。

Agilent 1290高效液相色谱仪,配Agilent 6520四极杆飞行时间质谱仪(德国Agilent公司); Sigma-16K高速离心机(美国Sigma公司); Mettler AE 240天平(梅特勒托利多仪器有限公司); Milli-Q纯水机(美国Millipore公司)。

N⁶-羟苄腺苷标准储备液:精密称取N⁶-羟苄腺苷对照品10 mg于10 mL容量瓶中,用50%(v/v)甲醇水溶液溶解、定容,得1 mg/mL 标准储备液。

内标溶液:精密量取6-苄氨基嘌呤适量,用甲醇溶解并稀释至200 ng/mL,备用。

SD大鼠,体重(200±20) g,购自大连医科大学实验动物中心,合格证号为SCXX(辽)2008-0002。实验动物给药前禁食24 h,自由给水。大鼠灌胃200 mg/kg 的N⁶-羟苄腺苷混悬液前及后0.42、0.75、1、2、4、8、12、24 h分别于眼底静脉取血并置于含有抗凝剂肝素钠的离心管中,于 3 000 r/min 离心10 min,取上清液于-80 ℃低温冰箱保存。

取100 μ L血浆样品,加入4倍体积的含1%(v/v)乙酸的乙腈沉淀蛋白质,涡旋1 min,于 12 000 r/min 离心10 min,取上清液至离心管中,50 ℃下氮气吹干,残渣用100 μ L 50%(v/v)甲醇水溶液复溶，供UPLC-MS/MS测定。

UPLC条件:色谱柱为Agilent ZORBAX SB-C18(150 mm×3 mm,1.8 μ m);柱温为60 ℃;流动相为0.2%(v/v)甲酸水溶液(A)和乙腈(B);梯度洗脱程序为0～5 min,15%B～40%B;流速为0.35 mL/min;进样量为20 μ L。

MS/MS条件:电喷雾离子(ESI)源,正离子模式;干燥气温度为350 ℃,干燥气流速为9 L/min;采集范围为m/z 50～750;采集频率为1.02 spectra/s;雾化气压力为0.31 MPa;毛细管电压为 3 500 V;碎裂电压为150 V;二级碎裂能量为25 eV。

比较了水-乙腈、0.2%(v/v)甲酸水溶液-乙腈、水-甲醇、0.2%(v/v)甲酸水溶液-甲醇流动相体系。结果表明,0.2%(v/v)甲酸水溶液-乙腈体系下待测物的峰形好且灵敏度高。对10 ng/mL 的N⁶-羟苄腺苷标准溶液分别进行正、负离子扫描,结果表明待测物在正离子模式下的响应明显高于负离子模式。最后对干燥气温度、流速、毛细管电压、采集频率进行了优化,使待测物的响应最大。另外,对内标进行了考察,分别以N⁶-二羟乙基腺苷、6-氯嘌呤核苷和6-苄氨基嘌呤为内标进行考察,结果显示6-苄氨基嘌呤与待测物得到很好的分离,且回收率高。因此选择6-苄氨基嘌呤作为内标。

表1

Table 1

表1(Table 1)

表1 N6-羟苄腺苷及内标的UPLC-MS/MS参数 Table 1 UPLC-MS/MS information of N6-(4-hydroxybenzyl) adenine riboside and IS Compound Formula tR/ min Experimental [M+H]+ (m/z) Theoretical [M+H]+ (m/z) Error/10-6 (ppm) Product ions N6-(4-hydroxybenzyl) adenine riboside C17H19N5O5 3.47 374.1450 374.1459 -2.4 242,136,107 6-Benzylamino purine C12H11N5 4.62 226.1081 226.1087 -2.7 106,91

表1 N6-羟苄腺苷及内标的UPLC-MS/MS参数 Table 1 UPLC-MS/MS information of N6-(4-hydroxybenzyl) adenine riboside and IS

图2为空白大鼠血浆、血浆加标准品和大鼠灌胃N⁶-羟苄腺苷1 h后的血浆样品的提取离子流图(提取质量窗口为10 ppm),图3为N⁶-羟苄腺苷的质谱图。从图2中可看出N⁶-羟苄腺苷和内标的保留时间为3.47和4.62 min,峰形良好,血浆中的内源性物质不干扰N⁶-羟苄腺苷和内标的测定。N⁶-羟苄腺苷及内标的相关质谱数据见表1。

图2

Fig. 2

图2 (a)空白血浆、(b)空白血浆加标(添加25 ng/mL N6-羟苄腺苷和20 ng/mL 内标)及(c)给药1 h后血浆样品(添加20 ng/mL 内标)的提取离子流图 Fig.2 Extracted ion chromatograms of (a) a blank plasma sample,(b) a blank plasma sample spiked with N6-(4-hydroxybenzyl) adenine riboside (25 ng/mL) and IS (20 ng/mL) and (c) a plasma sample after dosing 1 h (spiked with IS (20 ng/mL)) Peak identifications: 1. N6-(4-hydroxybenzyl) adenine riboside; 2. IS.

图3

Fig. 3

图3 N6-羟苄腺苷的(a)一级质谱图和(b)碎裂质谱图 Fig.3 (a) MS and (b) MS/MS spectra of N6-(4-hydroxybenzyl) adenine riboside

用50%(v/v)甲醇水溶液将N⁶-羟苄腺苷储备液稀释成质量浓度分别为2.5、5、10、20、40、80、160、320和640 ng/mL 的系列标准溶液。离心管中加入25 μ L标准溶液和10 μ L内标溶液，50 ℃下氮气吹干，加入100 μ L空白大鼠血浆，涡旋混匀30 s,其他操作同1.5节所述,制备成0.625～160 ng/mL 的加标样品,并进行UPLC-QTOF-MS测定。质控样品的制备、处理及测定同上,质控样品的质量浓度分别为5、25、100 ng/mL(低、中、高3个浓度)。以N⁶-羟苄腺苷和内标的峰面积比值的平均值(n=6)为Y,N⁶-羟苄腺苷的质量浓度为X,得到回归曲线Y=0.011 8X+0.017 45,相关系数r＞0.99。检出限(S/N=3)为0.1 ng/mL。

用空白大鼠血浆配制低、中、高3个质量浓度(同质控样品)的样品各5份,连续测定5天,考察日内与日间精密度(以RSD计)和准确度(以RE计，RE=(测定浓度-加标浓度)/加标浓度×100%)。结果表明,3个质量浓度的日内与日间的RSD均小于6% ，RE低于±15%(见表2)，满足生物样品分析要求。

表2

Table 2

表2(Table 2)

表2 空白大鼠血浆中N6-羟苄腺苷的日内、日间精密度和准确度 Table 2 Intra- and inter-day precisions and accuracies of N6-(4-hydroxybenzyl) adenine riboside in a blank rat plasma sample Spiked/ (ng/mL) Intra-day (n=5) Inter-day (n=5) Measured/(ng/mL) Precision (RSD)/% Accuracy (RE)*/% Measured/(ng/mL) Precision (RSD)/% Accuracy (RE)*/% 5.00 5.30 2.70 6.00 4.99 7.03 -0.20 25.00 21.63 2.43 -13.48 21.27 5.85 -14.92 100.00 88.75 5.98 -11.25 85.95 7.52 -14.05 * RE=(measured concentration-spiked concentration)/spiked concentration×100%.

表2 空白大鼠血浆中N6-羟苄腺苷的日内、日间精密度和准确度 Table 2 Intra- and inter-day precisions and accuracies of N6-(4-hydroxybenzyl) adenine riboside in a blank rat plasma sample

回收率为空白血浆中加入药物经提取后的药物响应值与空白血浆处理后加入相同量药物后药物响应值的比值;基质效应为具有基质的标准品与纯标准品的药物响应值的比值。用空白大鼠血浆配制低、中、高3个质量浓度(同质控样品,n=5)的大鼠血浆样品进行测定。N⁶-羟苄腺苷在低、中、高3个质量浓度的回收率为88.41% ～108.26% ,符合生物样品分析的要求;基质效应为95.54% ～109.48% ,因此可忽略基质效应的影响。结果见表3。

表3

Table 3

表3(Table 3)

表3 空白大鼠血浆中N6-羟苄腺苷的加标回收率和基质效应(n=5) Table 3 Recoveries and matrix effect of N6-(4- hydroxybenzyl) adenine riboside spiked in blank rat plasma (n=5) Spiked/ (ng/mL) Recovery Matrix effect Recovery±SD/% RSD/% Matrix effect±SD/% RSD/% 5 88.41±7.78 8.81 95.54±14.01 14.67 25 108.26±6.17 5.70 109.48±7.75 7.08 100 106.67±10.17 9.53 107.42±3.83 3.57

表3 空白大鼠血浆中N6-羟苄腺苷的加标回收率和基质效应(n=5) Table 3 Recoveries and matrix effect of N6-(4- hydroxybenzyl) adenine riboside spiked in blank rat plasma (n=5)

表4

Table 4

表4(Table 4)

表4 不同条件下大鼠血浆中N6-羟苄腺苷的稳定性 Table 4 Stabilities of N6-(4-hydroxybenzyl) adenine riboside in rat plasma under different conditions Stability Measured concentration (mean±SD)/(ng/mL) Spiked at 5 ng/mL Spiked at 25 ng/mL Spiked at 100 ng/mL Post-preparative stability 4.69±0.34 24.10±1.14 84.89±3.03 Short-term stability 5.17±0.58 21.82±0.18 87.69±6.99 Long-term stability 5.32±0.24 22.13±1.97 85.69±0.72 Freeze-thaw stability 4.61±0.38 26.16±0.01 86.48±5.19 Post-preparative stability: the prepared sample stored in an injector for 24 h. Short-term stability: the spiked rat plasma stored at room temperature for 6 h. Long-term stability: the spiked rat plasma stored at -80 ℃ for 30 days. Freeze-thaw stability: freeze-thaw for three cycles.

表4 不同条件下大鼠血浆中N6-羟苄腺苷的稳定性 Table 4 Stabilities of N6-(4-hydroxybenzyl) adenine riboside in rat plasma under different conditions

用空白大鼠血浆配制低、中、高3个浓度(同质控样品,n=5)的大鼠血浆样品,分别考察不同条件下样品的稳定性：在-80 ℃冰箱中保存30天(长期稳定性)、室温放置6 h(短期稳定性)、反复冻融3次(冻融稳定性)及处理后的样品在进样器中放置24 h(制备后稳定性)。结果(见表4)表明,样品中N⁶-羟苄腺苷在上述条件下稳定性良好。

应用本文建立的UPLC-QTOF-MS方法测定了大鼠灌胃N⁶-羟苄腺苷后血浆中N⁶-羟苄腺苷的含量。其平均血药浓度-时间曲线见图4,相应的药代动力学参数见表5。可以看出,大鼠灌胃N⁶-羟苄腺苷后1.15 h达到峰值(107.53 ng/mL),且N⁶-羟苄腺苷的半衰期为7.75 h。

图4

Fig. 4

图4 大鼠灌胃200 mg/kg N6-羟苄腺苷后的平均血药浓度-时间曲线(n=6) Fig.4 Mean plasma concentration-time profile for N6-(4-hydroxybenzyl) adenine riboside after intragastric administration of 200 mg/kg N6-(4-hydroxybenzyl) adenine riboside in rats (n=6)

表5

Table 5

表5(Table 5)

表5 大鼠血浆中N6-羟苄腺苷的药代动力学参数 Table 5 Pharmacokinetic parameters of N6-(4-hydroxybenzyl) adenine riboside in rat plasma Parameter Value Tmax/h 1.15±0.49 Cmax/(ng/mL) 107.53±46.39 t1/2/h 7.75±2.83 AUC/(ng\5h/mL) 433.55±86.11 CL/(L/(h\5kg)) 397.16±88.20 V/(L/g) 5.34±1.93 MRT/h 8.10±2.59 Tmax: time reached the maximum concentration. Cmax: maximum concentration. AUC: area under the curve. CL: clearance. V: apparent volume of distribution. MRT: mean residence time.

表5 大鼠血浆中N6-羟苄腺苷的药代动力学参数 Table 5 Pharmacokinetic parameters of N6-(4-hydroxybenzyl) adenine riboside in rat plasma

本实验建立了测定大鼠血浆样品中N⁶-羟苄腺苷的超高效液相色谱-四极杆飞行时间质谱分析方法。通过方法学验证和实际应用,证明该方法灵敏度高、重复性好、快速简便,适用于N⁶-羟苄腺苷血药浓度的测定及其药代动力学研究,为其临床药代动力学、药效学研究提供参考。