Agilent 7100毛细管电泳仪,配备二极管阵列(DAD)检测器(美国Agilent公司)。

软骨藻酸(DA)由国家海洋局海洋生物资源综合利用工程技术研究中心提供;人凝血酶(H-Thr)购自Enzo Life Sciences公司;细胞色素C(Cyt C)、胰蛋白酶(Try)、免疫球蛋白 E (Ig E)、核糖核酸酶A(RNase A)、 λ 核酸外切酶( λ Exo)、转铁蛋白(Trf)、铁蛋白(Fer)、凝集素(Lec)均购自Sigma公司;二甲基亚砜(DMSO,纯度＞99.5% )购自北京拜尔迪公司。

氢氧化钠、硼砂和硼酸(分析纯),购自北京化工厂;实验室用水为蒸馏水。

熔融石英毛细管购自邯郸市鑫诺光纤色谱有限公司。

将50 mmol/L Na₂B₄O₇溶液和200 mmol/L H₃BO₃溶液以6 ∶ 4的体积比混合,配制200 mmol/L(pH 8.7)硼酸盐储备液,并稀释为50 mmol/L(pH 8.7)硼酸盐溶液作为电泳缓冲液,经0.22 μ m滤膜过滤后使用。

精确称量软骨藻酸纯品 0.001 0 g,加水1 mL溶解,摇匀,作为储备液,质量浓度为1 mg/mL,-20 ℃保存。

熔融石英毛细管(有效长度/总长:40 cm/48.5 cm,内径75 μ m);进样压力:5 kPa;进样时间:5 s;分离电压:+20 kV；分离温度:25 ℃;检测波长:214 nm(亲和毛细管电泳),242 nm(毛细管区带电泳)。

新毛细管在使用前分别用1 mol/L NaOH、0.1 mol/L NaOH、H₂O各冲洗30 min。两次实验进样间用0.1 mol/L NaOH、H₂O和缓冲液各冲洗3 min。毛细管不用时两端水封，于室温下保存。

本文选用9种重要的功能蛋白质作为DA作用的靶标,其中人凝血酶、lgE、转铁蛋白、铁蛋白和凝集素为血浆蛋白;核糖核酸酶A和 λ 核酸外切酶为核酸酶;还有位于肠道中的胰蛋白酶及与生物氧化相关的细胞色素C。

亲和毛细管电泳通常可用于亲和配体和受体间结合常数的计算。将不同浓度的配体加入背景电泳溶液中,受体因与溶液中的配体发生亲和作用导致受体的迁移时间随配体浓度的增加而发生改变,即淌度迁移法。具体公式如下^[16]:

图2

Fig. 2

图2 DA与6种蛋白质的亲和毛细管电泳图 Fig.2 Affinity capillary electropherograms of domoic acid (DA) and six proteins DA: 0.2 mg/mL; dimethyl sulfoxide (DMSO): 0.1% (v/v). H-Thr: H-thrombin; Cyt C: cytochrome C; Try: trypsin; Ig E: immunoglobulin E; RNase A: ribonuclease A; λ Exo: λ exonuclease.

淌度迁移法一般可用于亲和力较强时受体配体相互作用的结合常数计算。但实验中,当亲和作用较弱时,结合常数为负值,故不能直接计算结合常数。因此,亲和作用弱时,可通过淌度比的变化量 Δ M随蛋白质配体浓度L的变化来定性比较亲和作用^[17]。当配体浓度L增加时,Δ M的增量越大,则受体与配体的相互作用越强。以 Δ M与L作线性图,斜率越大,表明相互作用越强。本实验中,以中性二甲基亚砜(DMSO)为电渗流标记物,将0、0.2、0.4、0.6、0.8 μ mol/L 的9种配体蛋白质(H-Thr、Ig E、Try、Cyt C、RNase A、 λ Exo、Trf、Fer、Lec)分别加入电泳缓冲液,检测0.2 mg/mL DA随蛋白质浓度增加的迁移时间改变。

图2和图3为亲和毛细管电泳图。图2电泳图中DA峰随蛋白质浓度增加,其迁移时间明显延长。由于蛋白质浓度增大,同时导致溶液黏度增大,通过电渗流变化进行校正,DA相对DMSO的迁移时间也增加。且6种蛋白质加入溶液时,DA峰随蛋白质浓度增加变矮展宽(见图2),表明DA和6种蛋白质之间存在相互作用。其中,以图2 H-Thr谱图中峰迁移最明显,H-Thr的浓度达0.6 μ mol/L 时,30 min已不能检测到DA的峰。相比之下,λ Exo的峰迁移最小,相互作用最弱。

Trf、Fer和Lec作为配体时,蛋白质浓度增加并未引起DA迁移时间的趋势性增加,DA也无明显的峰展宽(见图3),说明Trf、Fer和Lec与DA无明显相互作用。

图3

Fig. 3

图3 DA与3种蛋白质的亲和毛细管电泳图 Fig.3 Affinity capillary electropherograms of domoic acid and three proteins DA: 0.2 mg/mL; DMSO: 0.1% (v/v). Trf: transferring; Fer: ferritin; Lec: lectin.

进一步比较淌度比变化量 Δ M与9种蛋白质浓度L的线性图斜率,可知蛋白质与DA的相互作用强弱为:H-Thr＞Cyt C≈Try≈Ig E≈RNase A＞ λ Exo (见图4a)。而Fer、Trf、Lec未能表现出一定的亲和力(见图4b)。此处,亲和电泳图的直观比较与淌度比变化量 Δ M-蛋白质浓度L线性关系的斜率值判断结果一致。

根据以上结果初步推断,人体摄入DA后,DA有可能与胰蛋白酶结合,减少DA吸收入血。入血的DA又可与凝血酶较强结合,从而影响正常的凝血功能。DA还有可能在一定程度上减轻或抑制由血清Ig E含量过高而引起I型过敏反应。此外,DA与核酸酶RNase A,λ Exo也存在一定的亲和作用,可能引起DNA的损伤。细胞色素C存在于线粒体中,DA不易进入线粒体,但DA毒性可导致线粒体功能紊乱,诱发细胞色素C释放到细胞质,诱导细胞凋亡^[11]。因此,体内DA能否与细胞色素C发生作用,作用后是否产生生理影响等尚不得而知,需要进一步探讨。

图4

Fig. 4

图4 淌度比的变化量( Δ M)与蛋白质配体浓度(L)的关系 Fig.4 Relationships between variation of mobility ratio ( Δ M) and protein ligand concentration (L) a. six proteins interacting with DA; b. three proteins without interacting with DA.

目前尚未见到DA的亲和毛细管电泳研究报道。为了验证所建立的亲和毛细管电泳方法可靠,在1.3节所述实验条件下,进行了DA的毛细管区带电泳分析,并将此实验结果与李大志等^[8]采用BioFocus 3000全自动毛细管电泳仪的DA检测结果对比。由表1可知,本文的DA检测结果与文献^[8]基本吻合,且DA峰的迁移时间和峰面积的精密度和重现性更优。因此,利用亲和毛细管电泳法,根据DA迁移时间变化来定性分析9种蛋白质与DA的亲和作用可行。

表1

Table 1

表1(Table 1)

表1 软骨藻酸的线性范围、回归方程、相关系数、检出限、精密度及重现性 Table 1 Linear ranges,regression equations,correlation coefficients (R2),limits of detection (LODs), precisions and repeatabilities of domoic acid Method Linear range/ (μg/mL) Regression equation R2 LOD/ (μg/mL) Precisions (RSDs/%,n=6) Repeatabilities(RSDs/%,n=6) Peak area Migration time Peak area Migration time This research 0.2-100.0 y=2.8342 x+1.0845 0.9996 0.1 4.36 0.70 2.17 0.17 Ref. [8] 0.2-50.0 y=102414 x+55531 0.9990 0.063 - - 1.90 1.60 y: peak area; x: mass concentration,μ g/mL.

表1 软骨藻酸的线性范围、回归方程、相关系数、检出限、精密度及重现性 Table 1 Linear ranges,regression equations,correlation coefficients (R2),limits of detection (LODs), precisions and repeatabilities of domoic acid

基于亲和毛细管电泳法,将蛋白质作为配体加入电泳缓冲液,通过DA在电泳图中的淌度迁移可直观判断蛋白质与DA的相互作用强弱。通过DA淌度比与蛋白质浓度线性关系可定性比较相互作用强弱。由于DA具有强烈的神经毒性,对于可与DA作用的多种蛋白质的筛选,亲和电泳毛细管无疑是一种高效、快速、所需DA样品量极低的筛选方法。方法具有一定的普适性。