乙腈(色谱纯,ThermoFisher公司);甲酸(FA,纯度99% )、甲酸铵(纯度99.9% )(Acros公司);利巴韦林(德国Dr. Ehrenstorfer GmbH)，泛昔洛韦、伐昔洛韦、更昔洛韦和金刚乙胺(中国振翔科技有限公司)。低压四元色谱系统(ThermoFisher公司),配置LPG-3400SD低压四元色谱泵、WPS-3000TSL自动进样器、TCC-3200柱温箱、VWD-3100紫外-可见波长检测器、Corona Veo RS电雾式检测器、变色龙色谱管理软件Chromeleon 7.2。分析柱Acclaim C18 (150 mm×4.6 mm,5 μ m) (ThermoFisher公司); ZIC-pHILIC (150 mm×4.6 mm,5 μ m) (美国Merck公司); Click TE-Cys (150 mm×4.6 mm,5 μ m) (中国科学院大连化学物理研究所)。

反相色谱分离以Acclaim C18为色谱柱,流动相A为乙腈,B为0.1%(v/v)FA水溶液,洗脱梯度为0～15 min,5%A～18%A。以ZIC-pHILIC为固定相的亲水色谱分离,流动相A为乙腈,B为10 mmol/L 甲酸铵(pH 2.9),洗脱梯度为0～30 min,90%A～70%A。以Click TE-Cys为固定相的亲水色谱分离,流动相A为乙腈,B为100 mmol/L 甲酸铵(pH 2.9),C为水。流速:1 mL/min;柱温:30 ℃;紫外检测波长:254 nm。CAD检测条件:蒸发温度35 ℃;过滤模式5;采集频率10 Hz; PFV(power function value)值1.3。

以Acclaim C18为固定相,分别用CAD和紫外检测器检测几种抗病毒药物的响应情况,如图1a所示,利巴韦林的紫外吸收较弱,在254 nm波长下响应较小；金刚乙胺无法用紫外检测器直接检测。因此无法用紫外检测器同时检测5种抗病毒药物。CAD是一种通用型检测器,它是检测分析物颗粒表面的电荷量,适合半挥发和难挥发的化合物。CAD的响应与分析物的质量成比例,与分析物的光学性质无关。如图1b所示,5种抗病毒药物在CAD中都有较好的响应。因此,在下面的分离模式和流动相条件优化过程中以CAD为检测器。

图1

Fig. 1

图1 5种抗病毒药物在(a)紫外-可见波长检测器和(b) CAD 检测下的色谱图 Fig.1 Chromatograms of the five drugs obtained with (a) a UV-Vis detector and (b) a CAD Chromatographic column: Acclaim C18 (150 mm×4.6 mm,5 μ m). Mobile phases: A,ACN; B,0.1%(v/v) FA. Gradient: 0-15 min,5%A-18%A.

以3种不同色谱柱:亲水色谱柱(ZIC-pHILIC和Click TE-Cys)和反相色谱柱(Acclaim C18)为固定相进行抗病毒药物的分离,并以CAD为检测器检测。如图2a所示,在反相色谱模式中,金刚乙胺在死时间附近出峰,无法与死时间附近出峰的杂质分离。在C18色谱柱上,泛昔洛韦和抗生素水溶液中一杂质共洗脱,无法实现泛昔洛韦的定量分析。亲水色谱模式是反相色谱模式的有力补充。如图2b所示,在ZIC-pHILIC色谱柱上,金刚乙胺与杂质可以得到较好的分离。但5种碱性抗病毒药物在ZIC-pHILIC上都存在不同程度的拖尾和色谱峰展宽,导致分离度下降和检测灵敏度降低。如拖尾导致更昔洛韦和伐昔洛韦、利巴韦林和相邻杂质无法分离。此外,严重的拖尾和色谱峰展宽导致金刚乙胺检测灵敏度降低,甚至无法检测。与ZIC-pHILIC相比,以Click TE-Cys为固定相时所有待检测物质都可以获得更好的峰形(不对称因子A_s＜1.3)、更窄的峰宽(半峰宽W_1/2＜0.18 min)和更高的检测灵敏度。如以ZIC-pHILIC为固定相,泛昔洛韦的峰高为21 pA;以Click TE-Cys为固定相,泛昔洛韦的峰高为44 pA。与反相色谱分离相比,Click TE-Cys具有不同的分离选择性,5种目标化合物均得到基线分离(分离度R_s＞1.5)。此外,在Click TE-Cys上可以分离检测到一些无法在反相色谱模式中分离的杂质,如图2c中出峰时间为2.5、2.9、4.8和8.5 min的色谱峰。更好的分离度保证了各目标化合物更准确的定量。与蒸发光散射检测器(ELSD)一样,CAD的响应随流动相中有机相含量的增加而增加。反相色谱流动相中的乙腈含量远低于亲水色谱模式,因此5种抗病毒药物在反相色谱模式中的响应低于在亲水色谱模式中的响应。以Click TE-Cys为固定相,分析物中峰高最高的化合物的峰高是反相色谱模式下最高峰高的5倍。

图2

Fig. 2

图2 (a)Acclaim C18、(b)ZIC-pHILIC和(c)Click TE-Cys分析5种抗病毒药物的色谱图 Fig.2 Chromatograms of the five drugs obtained with (a) Acclaim C18,(b) ZIC-pHILIC and (c) Click TE-Cys columns Chromatographic conditions: a. the same as in Fig. 1. b. ZIC-pHILIC (150 mm×4.6 mm,5 μ m); mobile phases: A,ACN; B,10 mmol/L ammonium formate (pH 2.9); gradient: 0-30 min,90%A-70%A. c. Click TE-Cys (150 mm×4.6 mm,5 μ m); mobile phases: A,ACN; B,100 mmol/L ammonium formate (pH 2.9); C,water; gradient: 0-15 min,80%A-70%A,10%B,10%C-20%C. Peaks: 1. famciclovir; 2. rimantadine; 3. ribavirin; 4. ganciclovir; 5. valacyclovir; *. impurity.

在HILIC分离中,盐浓度和乙腈浓度对化合物的保留行为都有较为显著的影响。在盐浓度的优化实验中,保持缓冲盐的种类、pH(2.9)和乙腈梯度曲线不变,分别选取10、15和20 mmol/L 甲酸铵(pH 2.9)作为缓冲盐,考察盐浓度对目标化合物分离的影响。如图3所示,随着盐浓度的增加,化合物的保留时间稍有减少(＜1 min)。随着盐浓度的增加,化合物的选择性稍有变化,如利巴韦林、金刚乙胺以及介于两者之间的杂质。但无论用哪种盐浓度,都可以实现5种抗病毒药物的分离。为了减少盐对检测灵敏度度的影响,选择10 mmol/L 甲酸铵(pH 2.9)为流动相添加剂。

图3

Fig. 3

图3 甲酸铵浓度对5种抗病毒药物分离的影响 Fig.3 Effect of ammonium formate concentration on separation of the five antiviral drugs Chromatographic column: Click TE-Cys (150 mm×4.6 mm,5 μ m). Mobile phases: A,ACN; B,100 mmol/L ammonium formate (pH 2.9); C,water. Elution gradient: a. 0-15 min,80%A-70%A,10%B,10%C-20%C; b: 0-15 min,80%A-70%A,15%B,5%C-15%C; c. 0-15 min,80%A-70%A,20%B,0%C-10%C. Peaks: 1. famciclovir; 2. rimantadine; 3. ribavirin; 4. ganciclovir; 5. valacyclovir.

在乙腈浓度的优化实验中,分别选取85% ～75% 、80% ～70% 、75% ～65%乙腈作为有机相梯度,同时保持流动相中缓冲盐种类、浓度和pH值不变。如图4所示,所有化合物的保留时间都随流动相中乙腈浓度的增加而增加。以伐昔洛韦为例,使用乙腈梯度85% ～75% 、80% ～70% 、75% ～65%时,保留时间分别为5.5、8.0和11.7 min。为了实现较快的分离且保证几种抗病毒药物及杂质间较好的分离,选择乙腈梯度为80% ～70% 。

图4

Fig. 4

图4 乙腈梯度对5种抗病毒药物分离的影响 Fig.4 Effect of acetonitrile gradient on separation of the five antiviral drugs Chromatographic column: Click TE-Cys (150 mm×4.6 mm,5 μ m). Mobile phases: A,ACN; B,100 mmol/L ammonium formate (pH 2.9); C,water. Elution gradient: a. 0-15 min,85%A-75%A,15%B,0%C-10%C; b. 0-15 min,80%A-70%A,10%B,10%C-20%C; c. 0-15 min,75%A-65%A,15%B,10%C-20%C. Peaks: 1. famciclovir; 2. rimantadine; 3. ribavirin; 4. ganciclovir; 5. valacyclovir.

按照优化后的色谱条件,在0.07~2.28 mg/mL 范围内取5个点,每个浓度进样3次,每次进样5 μ L。如表1所示，以峰面积为纵坐标(A),质量浓 度为横坐标(C,mg/mL),考察利巴韦林、更昔洛韦、伐昔洛韦、泛昔洛韦和金刚乙胺的线性范围，并以S/N=10确定了5种抗病毒药物的定量限。

表1

Table 1

表1(Table 1)

表1 5种抗病毒药物的线性关系及LOQ Table 1 Linear relationships and LOQs of the five antiviral drugs Compound Linear range/ (mg/mL) Standard curve r2 LOQ/ (mg/mL) Famciclovir 0.07-2.28 A=7.696C+0.357 0.999 0.04 Rimantadine 0.07-2.14 A=4.977C+0.200 0.995 0.03 Ribavirin 0.06-2.02 A=3.711C+0.036 0.997 0.03 Ganciclovir 0.06-2.02 A=5.604C+0.364 0.998 0.03 Valacyclovir 0.07-2.33 A=5.068C-0.020 0.999 0.03 A: peak area (pA\5min); C: mass concentration of the analyte (mg/mL).

表1 5种抗病毒药物的线性关系及LOQ Table 1 Linear relationships and LOQs of the five antiviral drugs

以质量浓度为1.0 mg/mL 的金刚乙胺、利巴韦林、更昔洛韦、泛昔洛韦和伐昔洛韦混合溶液为样品,平行测定5次,检测本方法的峰面积重复性(见表2)。本方法测定泛昔洛韦、金刚乙胺、利巴韦林、更昔洛韦和伐昔洛韦有较好的日内重复性(RSD≤3.06% )和日间重复性(RSD≤5.38% )。

表2

Table 2

表2(Table 2)

表2 5种抗病毒药物峰面积的日内(n=5)和日间重复性(n=3) Table 2 Intra-day (n=5) and inter-day (n=3) peak area repeatability of the five antiviral drugs Compound Intra-day RSD/% Inter-day RSD/% Famciclovir 1.16 2.50 Rimantadine 0.81 2.84 Ribavirin 1.45 4.33 Ganciclovir 0.54 3.95 Valacyclovir 3.06 5.38

表2 5种抗病毒药物峰面积的日内(n=5)和日间重复性(n=3) Table 2 Intra-day (n=5) and inter-day (n=3) peak area repeatability of the five antiviral drugs