左旋肉碱(L-carnitine)是一种人体中天然存在的类维生素营养物质,其主要功能是转运脂肪进入线粒体,促进脂肪酸氧化,为机体提供能量[1, 2]。正常机体的左旋肉碱来源有两个:一是通过肝脏和肾脏进行内源性合成,二是从膳食主要是动物性食品中摄取[3]。体内缺乏左旋肉碱将干扰脂肪酸的代谢而导致能量合成不足,出现易疲劳、肌肉无力、心慌等症状,严重者会出现代谢紊乱,昏迷甚至死亡。随着人们对左旋肉碱营养价值的关注及认可,它已经被越来越多地用于减肥食品、婴幼儿食品、饮料、营养补充剂、临床等方面[4]。因为婴幼儿不能通过其不成熟的合成系统合成左旋肉碱,所以婴幼儿食品中的左旋肉碱对婴幼儿来说是一种重要的营养物质[5]。国家标准GB 10765-2010《食品安全国家标准 婴儿配方食品》规定,左旋肉碱为可选择性加入成分,规定最小添加量为0.003 mg/kJ。牛羊奶等作为动物源性食品,其中可能含有一定量的左旋肉碱,调研各类原料乳和乳制品中左旋肉碱的本底含量水平,在此基础上精确控制婴幼儿配方食品中左旋肉碱的添加量都需要发展一套能够准确定性定量的检测方法。GB 29989-2013 《食品安全国家标准 婴幼儿食品和乳品中左旋肉碱的测定》采用分光光度法进行检测,实验过程繁琐,所用的酶和试剂价格昂贵,且乳制品基质复杂,对左旋肉碱的定性定量可能产生干扰。左旋肉碱为极性化合物,在普通C18填料的反相色谱柱上基本没有保留,关于它的液相色谱分析的文献报道主要有采用磷酸盐缓冲液作流动相的液相色谱法[6, 7]、反相离子对色谱-质谱联用法[8],但在流动相中加入磷酸盐容易堵塞液相色谱系统,且与质谱不兼容;用七氟丁酸作为离子对试剂时会对质谱检测器有污染并影响灵敏度。竺琴等[5]采用C4色谱柱,以甲醇-水(10 ∶ 90,v/v)为流动相进行反相液相色谱分离、质谱检测,克服了使用离子对试剂带来的问题。
本研究采用亲水作用色谱-串联质谱(HILIC-MS/MS)技术,发展了一种简便、快速、准确检测乳和乳制品中左旋肉碱的检测方法。
超高压液相色谱-串联质谱联用(UPLC-MS/MS)仪,配有电喷雾离子(ESI)源(XEVO TQ-S,美国Waters公司)。
左旋肉碱标准物质(SIGMA公司);乙腈、乙酸铵为色谱纯;乙酸为优级纯;超纯水由Milli-Q超纯水机制备;氮气(纯度＞99.999% )。
色谱柱:Acquity UPLC BEH HILIC(100 mm×2.1 mm,1.7 μ m,美国Waters公司);流动相:20 mmol/L 乙酸铵溶液(A)和乙腈(B);梯度洗脱程序:0～4 min,20%A线性增至40%A;流速0.35 mL/min;柱温:40 ℃;进样体积:2 μ L。
电离模式:ESI正离子(ESI+);毛细管电压:3.0 kV;脱溶剂温度:350 ℃;脱溶剂气流量:650 L/min;锥孔反吹气流量:150 L/h;雾化气压力:7.0×105 Pa(7.0 bar);碰撞室压力:0.35 Pa(3.5×10-6 bar);低端分辨率:3.00;高端分辨率:15.00;离子能量:0.5;离子源温度:150 ℃;提取锥电压:3.0 V;入口透镜电压:0.8 V;出口电压:0.8 V;锥孔电压:38 V;采集模式:多反应监测(MRM)模式;左旋肉碱的母离子为m/z 162.0;定性离子对为m/z 162.0＞103.0,碰撞能量为16 eV;定量离子对为m/z 162.0＞60.0,碰撞能量为14 eV。
液体乳:称取2 g(精确至0.01 g)试样,置于25 mL比色管中,用0.2%(v/v)乙酸溶液定容至刻度,涡旋混匀;取0.5 mL该溶液至10 mL离心管中,用乙腈定容至10 mL,静置;取上清液过0.22 μ m有机滤膜,滤液供测定。
乳粉:称取0.2 g(精确至0.001 g)试样,置于50 mL比色管中,用0.2%(v/v)乙酸溶液定容至刻度,涡旋混匀;取0.5 mL该溶液至10 mL离心管中,用乙腈定容至10 mL,静置;取上清液过0.22 μ m有机滤膜,滤液供测定。
亲水作用色谱可以为强极性和强亲水性的化合物提供合适的保留,使用高比例有机相的流动相有利于提高质谱的离子化效率,从而提高质谱分析的灵敏度。本文采用Acquity UPLC BEH HILIC色谱柱进行分离,该色谱柱采用未键合的亚乙基桥杂化颗粒为固定相,能够实现强极性化合物的较好保留。分别考察了以10 mmol/L 乙酸铵、10 mmol/L 乙酸铵+0.1%(v/v)乙酸、20 mmol/L 乙酸铵为流动相水相的分离结果,结果表明:以20 mmol/L 乙酸铵和乙腈作为流动相时,左旋肉碱的峰形对称、保留适中,其标准溶液的HILIC-MS/MS谱图见图1。
将1.0 mg/L 的左旋肉碱标准溶液通过蠕动泵注入质谱仪,调谐并优化裂解电压、碰撞能量等参数,确定以m/z 162.0＞60.0和162.0＞103.0为定性离子对,以m/z 162.1＞60.0为定量离子对。
左旋肉碱易溶于水,但乳及乳制品的成分复杂,如直接用水提取,大量的杂质会同时被提取出来,从而影响左旋肉碱的离子化和检测。左旋肉碱在pH 3～6的水溶液中稳定性最好,同时考虑到ESI+模式的检测条件和初步沉淀蛋白质的作用,本研究采用0.2%(v/v)乙酸溶液进行提取。
乳及乳制品中富含蛋白质,去除蛋白质的方法主要有酸沉淀、沉淀剂沉淀和有机溶剂沉淀。本研究综合考虑了沉淀后的溶液与亲水作用色谱的兼容性,采用有机溶剂沉淀法,经考察比较发现乙腈的沉淀效果比甲醇更好。
取空白试样按照1.4节的方法制备空白基质溶液,用空白基质溶液将标准工作溶液逐级稀释,得到0.2、1、5、10、20、50、100 μ g/L 的系列标准溶液,按质量浓度从低到高依次经HILIC-MS/MS测定,以左旋肉碱定量离子对m/z 162.0＞60.0的峰面积Y对其质量浓度X( μ g/L)做标准曲线,得到线性方程Y=2.57×103X+3571.84,相关系数(r2)为0.995,线性关系良好。左旋肉碱的检出限(以S/N＞3计)为0.003 mg/kg,定量限(以S/N＞10计)为0.01 mg/kg。不同试样中所含的左旋肉碱含量水平差异较大,如果测定结果超出了本方法的线性范围,须使用初始流动相对样品溶液稀释后再测定。
将同一份液体乳、乳粉样品分成2份,其中一份作本底,另一份添加不同浓度的左旋肉碱标准溶液后按照本文建立的方法进行处理和测定,每份样品进行6次平行测定,考察方法的回收率和精密度,结果见表1。该方法的回收率为96.0% ～103.4% ,相对标准偏差(RSD)为1.2% ～4.3% ,可见方法的回收率高,重现性好。
GB 29989-2013《食品安全国家标准 婴幼儿食品和乳品中左旋肉碱的测定》的方法定量限为20 mg/kg,故在左旋肉碱含量较低的样品检测方面,本方法优势明显。通过对左旋肉碱不同含量水平的婴幼儿配方乳粉的检测对比发现,两个方法的相对偏差为2.6% ～23.4% 。
从市场上随机购买了50份液体乳和50份标示含有左旋肉碱的婴幼儿配方乳粉进行左旋肉碱的检测。结果表明,液体乳中均含有左旋肉碱,含量为1.7～10.9 mg/kg,平均含量为7.6 mg/kg。婴幼儿配方乳粉中左旋肉碱的含量为103～129 mg/kg,与其产品标签标示基本一致。
本研究建立了亲水作用色谱-串联质谱法测定乳及乳制品中左旋肉碱的分析方法。该方法前处理简单、精密度高、定性定量准确,适合各类乳制品中左旋肉碱的准确定性定量,是乳及乳制品中左旋肉碱本底含量水平调研的有效方法,也可为婴幼儿配方乳粉生产企业控制左旋肉碱添加量、正确标示含量水平提供有力的技术支持。
2015, Vol. 33 Issue (9): 943-945
PDF (728 KB)
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