肝脏是药物在体内代谢的最主要场所,药物在此进行聚合、氧化、还原、羟化以及去甲基化等一系列的代谢过程,从而在全身诸个脏器发挥效应,可想而知,肝脏是最容易遭受药物影响的脏器。药物诱导的肝损伤是许多药物被迫撤出市场的主要原因[1, 2]。据统计,在已上市应用的化合性或生物性药物中,有 1 100 种以上的药物具有潜在的肝毒性,很多药物的赋形剂、中草药以及保健药亦有导致肝损伤的可能[3]。迄今为止,药物肝损伤的早期诊断仍是临床工作者的一大难题,其发生、发展机制至今也尚未阐明，迫切需要新型肝毒性标志物的发现。代谢组学能够反映机体对病理、生理及基因改变引起的代谢变化,在疾病诊断[4, 5]、病理学[6]、药物安全性评价[7]等临床研究方面显示出明显的优势。应用代谢组学有助于发现在药物肝损伤早期发生显著变化的标志性代谢物。
本研究旨在应用细胞代谢组学技术揭示不同类型药物肝损伤的代谢谱,进而筛选肝毒性相关差异代谢物。通过对内源性代谢物的表征能够找出与药物肝损伤相关的代谢通路,有助于指导肝损伤的治疗[8]。四氯化碳是公认的化学类肝脏毒物。相关的研究工作发现,在四氯化碳诱发的肝损伤中,机体的胆汁酸代谢、脂肪酸代谢和能量代谢发生了紊乱[9, 10, 11]。对乙酰氨基酚(APAP)诱导的肝损伤是西药肝损伤的经典模型,通常作为肝损伤研究的阳性对照模型[8]。大量的研究显示APAP可以干扰肝脏正常的氨基酸代谢和脂质代谢[12, 13, 14]。大黄素、雷公藤甲素和马兜铃酸是中药的主要活性成分,具有多种药理作用。然而,近年来关于其引起肝损伤的报道屡见报端[15, 16],但对于其肝损伤的机制仍存在争议。
本研究以人源性正常肝细胞HL7702为模型,利用超高效液相色谱-质谱联用(UPLC-MS)技术对以上药物诱导的肝损伤细胞模型进行代谢轮廓分析,应用模式识别构建分类模型,筛选、鉴定并验证与肝毒性相关的差异代谢物,结合代谢通路进行相关讨论。本研究为药源性肝损伤新型标志物的发现及肝毒性早期诊断提供了参考。
试剂:人源性正常肝细胞(HL7702,上海和园生物技术有限公司)。甲醇、乙腈(色谱纯,美国Sigma-Aldrich公司)。甲酸(色谱纯,天津科密欧公司)。RPMI-1640培养基、胎牛血清(美国Gibco公司)。3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴盐(3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide,MTT)、胰蛋白酶和蛋白定量试剂盒(北京索莱宝公司)。马兜铃酸(CAS No. 313-67-7,纯度98% ,批号140416,中国食品药品检定研究所)，对乙酰氨基酚(CAS No. 103-90-2,纯度99.0% ,批号l1318049)和四氯化碳(光谱纯,批号112044,上海阿拉丁公司)。联苯双酯(DDB,纯度99.0% ,批号100192-200503)、大黄素(CAS No. 518-82-1,纯度98% ,批号0756-200110)和雷公藤甲素(CAS No. 38748-32-2,纯度98% ,批号111567-201404)(中国食品药品检定研究所)。超纯水由Milli-Q纯化系统(美国Millipore公司)制备。
仪器:高速离心机(美国Sigma-Aldrich公司); Sunrise酶标仪(瑞士帝肯公司);离心浓缩干燥器(美国Thermo公司)。Mini-Beadbeater 16.0(美国Biospec公司)。Agilent 1290 Infinity超高效液相色谱仪(美国Agilent公司)。Agilent 6520四极杆飞行时间质谱仪(Quadrupole time-of-flight mass spectrometry,Q-TOF-MS,美国Agilent公司)。色谱柱为Zorbax Eclipse plus C18柱(150 mm×3.0 mm,1.8 μ m,美国Agilent公司)。
HL7702细胞置于含10%胎牛血清的RPMI-1640培养基中,于37 ℃、5% CO2、饱和湿度条件下培养。细胞贴壁生长,每1～2天换液一次。取对数生长期细胞,用胰蛋白酶消化细胞制成单细胞悬液,以每孔105个细胞接种到96孔板中,常规培养24 h,弃去培养基,药物组分别加入用新鲜培养基配制的系列浓度梯度的APAP、四氯化碳、大黄素、雷公藤甲素、马兜铃酸和雷公藤甲素-联苯双酯溶液,各浓度设置3个复孔,共培养48 h。对照组加入完全培养基,空白组不加细胞,只加培养基。采用MTT染色,酶标仪于570 nm波长检测各孔的光密度值(OD)。以细胞抑制率=(对照组OD-药物组OD)/(对照组OD-空白组OD)×100%计算细胞抑制率。
按照1.2节方法,将细胞以每孔2×106个细胞接种到6孔板中,过夜后,分别加入拟定浓度的APAP、四氯化碳、大黄素、雷公藤甲素、马兜铃酸和雷公藤甲素-联苯双酯溶液,共培养48 h建立肝损伤模型。平行设置对照组,每组设置6个复孔。弃掉培养基,用50 mmol/L PBS缓冲液淋洗3次,用细胞刮轻轻刮取细胞样品,以 1 000 r/min 离心5 min获得细胞饼,储存于-80 ℃超低温冰箱中。
胞内代谢物提取方法在文献[17]报道方法的基础上稍作修改。采用200 μ L 80%冷甲醇水溶液(-80 ℃)淬灭细胞,用Mini-Beadbeater匀质机裂解细胞,参数如下:匀质1 min,间隔20 s,重复匀质1 min。裂解液于 12 000 r/min 离心10 min,取上清液,真空抽干,复溶于100 μ L 5%(v/v)乙腈水溶液。样品沉淀蛋白采用蛋白定量试剂盒定量,方法按照说明书进行。总蛋白定量用于校正样本间由细胞数目差异引起的代谢物变化。同时吸取各样本20 μ L混匀制成质控样本,用于监测仪器的稳定性。所有复溶后的样本储存于-80 ℃冰箱中,待检测。
色谱系统参数:柱温为50 ℃。流动相A为0.1%甲酸水溶液,流动相B为乙腈。洗脱梯度:0～3 min由5%B线性升到50%B; 3～15 min由50%B线性升到100%B,保持5 min; 20～20.1 min由100%B线性降至5%B并保持5 min。
质谱系统参数:毛细管电压为 3 500 V,温度为350 ℃;进样锥电压为40 V;干燥气流速为8 L/min;雾化器压力为0.276 MPa,采用电喷雾电离(ESI)正离子模式检测。质量扫描范围为100～1 000 (一级质谱)和50～1 000(二级质谱)。采用Agilent实时校正液进行质量实时校正,确保质谱分析的准确性和重复性。样品分析过程采用随机进样的方式进行。样本分析前,首先进两针质控样本以稳定系统。随后,在分析过程中,每进6个样本,重复进质控样本一次,连续监控系统的稳定性和重复性。
将UPLC-MS获得的原始质谱数据通过在线软件XCMS进行峰识别、峰对齐和峰匹配[18]。所得数据矩阵经过80%规则、蛋白差异校正和面积归一化处理,然后导入SIMCAP 11.5软件进行模式识别分析。本研究采用主成分分析(PCA)模型区别各组代谢谱差异,采用偏最小二乘法判别分析(PLS-DA)模型筛选差异代谢物。通过R2X、R2Y、Q2参数值评价模型质量,其中R2X、R2Y越接近1表示模型越稳定,Q2＞0. 5表示预测率高。
根据PLS-DA模型得到的变量权重值(VIP)筛选潜在的肝毒性标志物。实验中采用T检验验证代谢物差异是否具有统计学意义。对具有显著差异的潜在标志物进行鉴定,鉴定方法借鉴已有报道[19];首先,确定代谢物的准分子离子峰;其次应用代谢物的精确相对分子质量检索数据库(http:/ /metlin.scripps.edu)、HMDB (http:/ /www.hmdb.ca/)、ChemSpider (http:/ /www.chemspider.com)、KEGG (http:/ /www.genome.jp)、Lipid Maps (http:/ /www.lipidmaps.org),质量偏差为10×10-6 (10 ppm),由此得到多个候选物;最后由标准品进行验证或者对代谢物进行二级质谱分析,根据二级碎片检索质谱数据库确定化合物结构。
为了获得高质量的适用于代谢组学分析的数据,本研究严格控制实验条件。分析过程中,不同组的样品随机进样分析,采用XCMS程序包检测所有样本保留时间的重复性,结果显示保留时间偏差＜24 s(见图1a),符合分析要求[20]。对质控样本进行主成分分析,结果显示质控样本随时间的变化控制在±2SD之内(见图1b),说明整个分析过程重复性和稳定性良好。筛选质控样本中峰面积的相对标准偏差(RSD)小于30%的变量(占总变量数的70%以上),对其在生物样本中的变化进行多元统计分析[21]。基于以上结果,可以认为各组之间的差异是由生物学差异而非分析方法引起的。
作用48 h,药物对HL7702细胞的抑制率呈现剂量依赖的趋势(见图2)。随着药物浓度的增加,其对肝细胞的抑制率增强,最终达到相对最大值。根据抑制率曲线计算各药物的半抑制浓度(IC50值),分别为:APAP,13 mmol/L;大黄素,28 μ mol/L;雷公藤甲素,36 nmol/L;马兜铃酸,70 μ mol/L。由于四氯化碳在培养基中的溶解度限制,其干预剂量并未达到IC50值,但是四氯化碳浓度大于4 mmol/L 时,对肝细胞具有显著的抑制作用(P＜0.05)。基于以上实验结果,用于构建细胞损伤模型的药物剂量分别为:APAP,6.5 mmol/L;大黄素,14 μ mol/L;雷公藤甲素,18 nmol/L;马兜铃酸,35 μ mol/L;四氯化碳,4 mmol/L。剂量选择的依据是采用IC50的一半剂量或者采用诱导细胞显著损伤(P＜ 0.05)的剂量(四氯化碳)[22, 23]。采用以上剂量构建肝细胞损伤模型,对不同类型肝损伤模型进行代谢组学分析。
对各类型药物肝损伤的代谢谱进行PCA分析,结果见图3a,正常组、APAP损伤组、四氯化碳损伤组和中药活性成分损伤组(大黄素、雷公藤甲素和马兜铃酸)呈现明显的聚类特征。高度集中的质控样本点表明该分析过程具有较好的重复性和稳定性。以上结果表明,不同类型的肝损伤在代谢物水平上具有显著的差异。
为了区别不同类型的肝损伤,寻找肝损伤差异代谢物,进一步对代谢组学数据进行PLS-DA分析。结果见图3b,表示模型解释能力的参数R2Y=0.964,表示模型预测能力的参数Q2=0.871,而且Q2intercept=-0.412(见图3c),这些参数说明该模型可靠,不存在过拟合现象。
根据PLS-DA得到的变量权重值(VIP值),筛选出VIP ＞ 1.5的变量作为肝毒性差异变量(见图4a)。对差异变量在各样本中的相对含量进行热图分析,结果见图4b,可以看出与正常组相比,损伤组中变量的水平发生了显著的变化。最终鉴定出14个潜在的肝毒性标志物(见表1),包括植烷酸、13,14-二羟基-二十二烷酸、2-羟基-植烷酸、2-羟基-二十二烷酸、13-二十二烯酸、13-十八烯醇、3-羟基-二十四烷酸、4-羟基-6-二十二烷酮、烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)、谷胱甘肽(GSH)、鞘氨醇、苯基甘氨酸和小肽。其中,植烷酸、13,14-二羟基-二十二烷酸、2-羟基-植烷酸、2-羟基-二十二烷酸、13-十八烯醇、3-羟基-二十四烷酸和4-羟基-6-二十二烷酮均为脂类,与正常组相比,损伤组的含量都显著性升高。脂类化合物的显著变化表明药物肝毒性扰乱了肝细胞内长链脂肪酸的正常代谢,尤其是脂肪酸的氧化过程。
已有研究显示,很多肝脏毒物,如乙醇、丙酮等,可以干预细胞色素酶P450的活性和脂肪酸的氧化过程。脂肪酸的羟基化过程与细胞色素酶CYP2E1的活性密切相关[24, 25]。例如,亚型CYP4A与脂肪酸的 ω 羟基化有关[26]。综上可以推测,本研究中脂肪酸代谢发生变化是由于药物对细胞色素酶活性的影响所致。除此之外,肝细胞内氧化应激的发生也 是导致脂肪酸代谢紊乱的因素之一。NAD和GSH是维持肝细胞内氧化还原平衡的两种重要代谢物。NAD广泛存在于各种组织中,作为一种电子载体,参与多种酶促反应,如脂肪酸氧化[27, 28]。GSH是一种细胞抗氧化剂,GSH调节的药物代谢往往是胞内GSH耗竭的主要原因[29]。GSH耗竭会导致氧化应激和脂质过氧化的发生。因此,药物干预后肝细胞内NAD和GSH耗竭,进一步导致氧化应激和脂肪酸代谢紊乱是药物肝损伤的主要原因。
为了验证肝损伤差异代谢物的可靠性,采用保肝阳性药联苯双酯对雷公藤甲素损伤的肝细胞模型进行治疗。细胞活性检测结果显示,联苯双酯对肝损伤的减弱作用具有剂量依赖性,剂量大于40 μ mol/L 时,可以显著减弱雷公藤甲素对肝细胞活性的抑制作用(见图5a)。根据细胞活性实验,我们选择联苯双酯有效剂量40 μ mol/L 和雷公藤甲素共同干预肝细胞48 h,平行设置正常对照组和雷公藤甲素损伤组。收集细胞样品按照上述方法进行代谢组学分析。模式识别结果显示,损伤组、共同干预组和对照组呈现较好的聚类效果(见图5b),共同干预组有向正常组靠近的趋势,由此推测联苯双酯对肝损伤具有一定的减弱作用,另一方面也验证了代谢组学用于药物肝损伤标志物研究的可行性。联苯双酯对已鉴定到的14种潜在标志物的调控作用见图6。结果显示,这些代谢物的水平都有一定程度的恢复,由此验证这些代谢物均与药物肝毒性有着密切的关系。作为临床上常用的肝损伤治疗药物,联苯双酯可在一定程度上治疗肝损伤引起的机体代谢紊乱,常被用作研究新型保肝药的阳性对照药[30]。因此检测联苯双酯干预肝细胞后标志代谢物的变化,可在一定程度上验证肝毒性标志物的可靠性。
本文采用基于UPLC-MS的细胞代谢轮廓分析,检测了不同类型药物肝损伤的代谢谱特征,结合多元统计分析,筛选了与药物肝毒性相关的代谢物,包括羟基化脂肪酸及衍生物、NAD、GSH和小肽。代谢通路分析显示药物损伤后,肝细胞的脂肪酸代谢和氧化应激发生了显著变化,与现有文献报道情况基本相符。通过保肝阳性药联苯双酯对肝损伤模型的代谢谱调控研究,验证了肝毒性潜在标志物的可靠性。本研究结果证明,通过细胞代谢物的差异表达来寻找与肝损伤相关的差异代谢物是一种简单有效的方法,可以与传统的以动物、临床病人血液、尿液为样本的代谢组学研究相互佐证与补充,以期为临床肝损伤的诊断、治疗提供准确全面的信息。
2015, Vol. 33 Issue (7): 683-690
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