生命体系的高度复杂性对高选择性、高灵敏度的分离分析新方法提出了迫切需求。从普遍存在于生命活动中的分子识别出发,构建高亲和力、高选择性的分子探针,发展分离分析新材料和检测新技术,可望为复杂生命体系中关键分子的结构与功能探测提供方法依据,对于实现在分子水平解答复杂生命问题具有重要意义,因而成为分析化学和生命科学研究的热点与前沿。

多肽作为重要的生理活性物质,不仅参与并调控着几乎所有生命过程,而且是生命物质蛋白质的结构单元。与抗体等大分子探针相比,多肽具有相对分子质量小、性质稳定、可控、作用快、易于实时监测等优点,在复杂生命体系的快速、动态分析中表现出巨大的潜力。

随着分离技术的发展,新的具有生物学和生理学活性的多肽不断地被发现并加以利用。由精氨酸、甘氨酸和天冬氨酸组成的三肽(Arg-Gly-Asp,RGD)可以说是最广为人知的靶向多肽探针。RGD是天然存在于细胞外基质蛋白质中的共有序列,是基质蛋白质特异性结合细胞膜整合素的关键结构。随着整合素在一些肿瘤细胞中高表达这一事实的揭示,结构简单、易于化学合成与修饰的RGD便成为炙手可热的肿瘤靶向探针,以之为工具建立的活细胞分析方法层出不穷。最近,Shi等^[1]以5代聚酰胺-胺型树状高分子为组装平台,以RGD为靶向识别单元,通过引入Gd(Ⅲ)和金纳米颗粒分别作为核磁共振(MR)和电子计算机X射线断层扫描(CT)显影剂,设计合成了多功能的多肽靶向纳米探针,并依此建立了CT/MR双模态活体成像检测方法。在RGD与整合素的特异性亲和识别作用下,探针实现了荷瘤小鼠内整合素高表达肿瘤组织的高选择性、高灵敏度检测。Pascu等^[2]基于RGD的肿瘤靶向能力,以带色氨酸标签的萘酰亚胺为荧光团,设计了新型的多肽荧光探针,建立了双光子活细胞成像和荧光寿命分析新方法,通过感知多肽探针所处的微环境和定位,实现了肿瘤细胞行为的探测。除了检测之外,RGD在肿瘤细胞选择性分离收集新材料的研究中也展现了诱人的应用前景。Li等^[3]制备了以RGD为模板分子的热响应性分子印迹水凝胶,利用RGD与细胞膜的黏附功能,通过温度响应的结合和释放,实现了在正常培养温度(37 ℃)下细胞能更好地黏附和贴壁生长,在低温(20 ℃)下细胞可控脱附以及收集,是一种极具前景的细胞分离生物材料。

相比于细胞膜上疾病相关分子变化的特异性分析检测,细胞内部的分子代谢过程更为复杂,其稳定或紊乱则是疾病发生发展的本质所在。如何穿透细胞膜这一天然屏障,实现细胞内部分子事件的识别与分析,历来是一个具有挑战性的科学问题。利用多肽丰富的物理化学性质和可设计性,穿膜肽及其在跨膜靶向输运方面的应用研究取得了令人瞩目的成果。最近,Pei等^[4]利用比传统穿膜肽(如Arg₉、Tat和penetratin)具有更强跨膜运输效率的环状多肽cF Ф R₄,设计出可形成分子内二硫键的新型穿膜肽,在进一步提高了运载效率的同时,增加了抗酶解稳定性。基于二硫键在细胞内氧化还原活性物种作用下具有可逆开关作用,建立了多种直链靶向多肽的细胞内高效转运与释放新方法,其对于细胞内目标物质的高选择性监测和动态分析具有重要作用。底物肽是另一类用于细胞内部蛋白酶靶向分析的有力探针。Tang等^[5]以在肿瘤细胞中高表达的基质金属蛋白酶为靶标,以其底物肽为识别单元,在金纳米颗粒表面构建了可同时识别肿瘤相关蛋白质与信使RNA(mRNA)的纳米探针。利用金纳米颗粒的透膜性和荧光淬灭效应,实现了细胞质内基质金属蛋白酶作用下底物肽携带荧光的可控打开,建立了一种准确、可靠的肿瘤细胞多指标检测新方法。

随着对多肽的结构、功能及其相互作用模式研究的日益深入,研究的焦点不仅仅停留在分离、分析内源性生物活性肽,而是更多地转向设计、合成和筛选具有特定功能的多肽。诺贝尔奖获得者Merrifield发明的固相多肽合成法使人工合成数量巨大、结构高度多样性的多肽组合化学库成为可能。然而,天文数字般庞大的肽库容量对高通量的筛选方法、检测灵敏度以及表征手段都提出了巨大的挑战。最近,Urbach等^[6]在获得亲和力和选择性可比拟抗体的人工靶向识别多肽研究方面取得了重要的进展。他们以葫芦^[8]脲(Q8)为模拟受体分子,基于Q8对N端为芳香型氨基酸的多肽具有识别作用,设计了库容量为105的肽库,在荧光筛选的基础上,进一步结合¹H NMR、ESI-MS以及量热滴定分析方法,筛选得到与受体分子具有nmol级亲和力的三肽Tyr-Leu-Ala,在分子相互作用中显示了序列与结构的高度特异性。计算机辅助设计和分子模拟是靶向多肽合理构建的另一有效途径。Luyt等^[7]通过计算机辅助设计和理论计算,构建了一系列具有不同结构的多肽,对树状结构多肽的进一步环化反应获得了具有络合能力的环状多肽,建立了基于¹H NMR、圆二色光谱和分子模拟的分子相互作用分析新方法,显示具有环状 β -折叠的多肽结构可望成为蛋白质-蛋白质分子相互作用成像研究的有效探针。在活体分析研究方面,Cheng等^[8]以小分子环辛炔为组装平台,设计合成了一类以多肽为肿瘤识别分子的靶向探针,最终以特异性结合尿激酶型纤溶酶原激活因子的多肽AE105为识别单元构建了多功能探针,实现了模型小动物中正电子发射计算机断层扫描与近红外荧光成像(PET/NIRF)的肿瘤双模态分析检测,获得了高组织特异性和高信噪比。

亲和色谱是基于生物分子间专一性相互作用而发展的一种独特的高选择性色谱分离分析方法。将高生物相容性的高效亲和色谱技术与肽库的理性设计相结合,是筛选特异性靶向多肽分子的有效途径。Zhao等^[9]在正义肽-反义肽相互作用规律研究的基础上,提出了基于反义肽简并性与高效亲和色谱的靶向多肽的功能导向设计筛选新策略。以新型肿瘤相关蛋白溶酶体4次穿膜蛋白(LAPTM4B)为靶点,利用所获得的优选肽,构建了信号可控的多肽靶向荧光探针,实现了不同组织来源肿瘤细胞的高灵敏度、高信噪比的成像检测和长时程动态监测^[10];建立了多肽导向的肿瘤细胞光动力学杀伤新方法,在细胞水平探索了对多种癌细胞的高选择性杀伤,而正常细胞的活力不受影响^[11]。

分子识别这个从分子水平阐释生命现象的化学概念,在分离科学中发挥着举足轻重的作用,不仅体现在色谱分离模式中,也是解决样品处理难题、发展高选择性检测手段的有效途径。靶向多肽探针以其高选择性、高度多样性和灵活可控的特点,可望为复杂生命体系中生物活性分子的快速、高选择性分离分析提供新工具和新材料,在实时、在线与活体分析中极具潜力。近年来,各种具有靶向识别能力的多肽类化合物虽然取得了一系列新的研究进展,但仍需发展多肽的设计、合成、筛选新方法,以获得具有高选择性、高亲和力的活性多肽,而色谱将在其中扮演越来越重要的角色,发挥快捷、高效、高通量的作用。