Agilent 1100高效液相色谱仪(配紫外/可见光检测器、自动进样器,美国Agilent公司);球形硅胶(粒径5 μ m,比孔容0.74 mL/g,比表面积324 m²/g,日本富士公司；使用前先用10%(质量分数)的盐酸活化6 h，并于140 ℃下真空干燥8 h后备用);乙腈(色谱纯,美国Sigma-Aldrich公司); 去离子水(电阻率＞18 M Ω \5cm,美国Milli-Q水处理系统制备);异氰酸丙基三乙氧基硅烷(3-(triethoxysilyl) propylisocyanate,纯度95% )、 乙酸铵(色谱纯)、乙酸(色谱纯)、木糖醇(纯度99% )、麦芽糖醇(纯度95% )(上海阿拉丁试剂公司);淫羊藿苷及其类似物(由本实验室制备并提供);吡啶(使用前用氢化钙干燥处理);其他试剂均为分析纯并直接使用。

合成路线如图1所示。取5.0 g干燥的木糖醇/麦芽糖醇溶于100 mL无水吡啶中,加热至80 ℃,由滴液漏斗滴加6.8/3.0 g异氰酸丙基三乙氧基硅烷后继续反应6 h;待反应液冷却后加入6 g干燥硅胶,回流反应24 h;冷却后抽滤,依次用适量的吡啶、乙醇、水、乙醇和丙酮洗涤,最后于60 ℃下真空干燥6 h即得到糖醇键合硅胶。

图1

Fig. 1

图1 木糖醇和麦芽糖醇键合硅胶的合成路线 Fig.1 Synthesis route of xylitol/maltitol modified silica

采用匀浆法将所制备的固定相装入250 mm×4.6 mm的不锈钢色谱柱管中。乙酸铵水溶液的pH用乙酸调节,死时间用甲苯测得,作为样品的化合物质量浓度为0.1～1 g/L。

元素分析给出木糖醇键合硅胶的碳、氢元素的质量分数分别为7.76% 、1.41% ,麦芽糖醇键合硅胶的碳、氢元素的质量分数分别为8.21% 、1.51% 。碳元素含量的增加有力地证明了通过图1所示的简单合成方法可以将糖醇分子成功地键合于硅胶表面。利用公式S=1 000×C/N×M_c(其中S为糖醇基团键合密度,单位为mmol/g；C为碳元素的质量分数;N为键合基团中的碳原子数;对于木糖醇和麦芽糖醇键合基团来说，N分别为9和16;M_c为碳原子的摩尔质量)计算糖醇的键合密度分别为0.72 mmol/g和0.43 mmol/g,木糖醇的键合密度约为麦芽糖醇的1.7倍,产生这种差异的原因是相对分子质量较大的麦芽糖醇受到较大的空间位阻影响,因而键合密度明显小于相对分子质量较小的木糖醇。

利用3种极性化合物(胸苷、胞嘧啶和鸟嘌呤)评价糖醇柱的保留能力、峰对称性和柱效。它们在木糖醇柱上的保留因子(k)分别为1.82、13.85和17.51,峰不对称因子分别为0.79、0.91和0.90,柱效约为 16 000 N/m;在麦芽糖醇柱上的保留因子分别为2.06、11.22和12.46,峰不对称因子分别为0.65、0.67和0.69,柱效在 21 000～24 000 N/m之间。
上述结果表明这两种糖醇柱对极性化合物都有很强的保留能力;相较之下,麦芽糖醇柱的柱效稍优于木糖醇柱,但峰对称性较木糖醇柱差,这是因为麦芽糖醇键合密度较低导致硅胶基质表面残留了较多的硅羟基。此外,在长时间使用中这两种糖醇柱均表现出一定的稳定性和重复性,如连续10次进样分析,两种糖醇柱的保留时间的相对标准偏差均不超过0.3% 。

选择10种极性和亲水性化合物作为测试样品,通过增加流动相中乙腈的含量(5%(v/v,下同)～95% )研究糖醇柱的保留机理。如图2所示,在两种糖醇柱上,乙腈含量对保留因子的影响皆呈J形曲线,这是典型的亲水作用色谱的保留曲线,一般认为其保留机理为分配机理。曲线拐点在乙腈含量为40%附近,当乙腈含量小于40%时,保留较弱且随乙腈含量的降低并未出现明显增加,而在亲水作用色谱主导区域(乙腈含量大于40% ),保留会随乙腈含量的增加而显著增强。与其他化合物不同的是,对氨基水杨酸和淫羊藿苷在麦芽糖醇柱上仅以亲水作用为主(J形曲线),但在木糖醇柱上表现为U型曲线的特征,即亲水作用色谱和反相色谱混合模式,这是因为木糖醇键合硅胶因OH/CH(CH₂)基团的摩尔比和极性基团数目均小于麦芽糖醇键合硅胶而表现出了一定的疏水(反相色谱)作用。

图2

Fig. 2

图2 流动相中乙腈含量对极性和亲水性化合物在(a)木糖醇和(b)麦芽糖醇柱上的保留影响 Fig.2 Effect of acetonitrile content in the mobile phase for the retention of polar and hydrophilic analytes on (a) xylitol and (b) maltitol columns Mobile phase: acetonitrile/20 mmol/L ammonium acetate,pH 4.0; flow rate: 1 mL/min; injection volume: 2 μ L; detection: UV at 254 nm; temperature: 25 ℃.

利用4种极性/亲水性模型混合物评估木糖醇柱和麦芽糖醇柱的分离性能,模型混合物包含酸性、碱性和中性化合物以及电解质和非电解质,其中碱基及其相应的核苷是评估HILIC柱最常用的模型化合物,利于与文献中报道的其他HILIC固定相进行比较。图3～6为4种模型混合物在优化条件下的色谱图。总体来看,木糖醇柱能够很好地分离水溶性维生素、水杨酸及其类似物、碱基及其相应的核苷,而淫羊藿苷类似物、胸腺嘧啶和尿嘧啶在木糖醇柱上不能达到基线分离;相比之下,麦芽糖醇柱对这4种模型混合物均有良好的分离效果,仅仅腺苷和腺嘌呤在麦芽糖醇柱上不能得到基线分离。

图3

Fig. 3

图3 水溶性维生素在(a,b)木糖醇和(c)麦芽糖醇柱上的分离 Fig.3 Separation of water soluble vitamins on (a,b) xylitol and (c) maltitol columns Mobile phases: acetonitrile/20 mmol/L ammonium acetate (85/15,v/v),pH 5.0 for Fig. 3a and Fig. 3c,pH 4.2 for Fig. 3b; flow rate: 1 mL/min; injection volume: 5 μ L; detection: UV at 254 nm; temperature: 25 ℃.1. vitamin PP; 2. vitamin B6; 3. vitamin B2; 4. vitamin C; 5. vitamin B3.

图4

Fig. 4

图4 水杨酸及其类似物在(a)木糖醇和 (b,c)麦芽糖醇柱上的分离 Fig.4 Separation of salicylic acid and its analogues on (a) xylitol and (b,c) maltitol columns Mobile phases: acetonitrile/20 mmol/L ammonium acetate (90/10,v/v) for Fig. 4a and Fig. 4b,acetonitrile/40 mmol/L ammonium acetate (90/10,v/v) for Fig. 4c,pH 5.0; flow rate: 1 mL/min; injection volume: 5 μ L; detection: UV at 220 nm; temperature: 25 ℃.1. salicylamide; 2. salicylic acid; 3. salicin; 4. 4-aminosalicylic acid; 5. acetylsalicylic acid; 6. 3,4-dihydroxyphenylacetic acid.

图5

Fig. 5

图5 碱基及其相应核苷在(a)木糖醇和 (b)麦芽糖醇柱上的分离 Fig.5 Separation of nucleic acid bases and nucleosides on (a) xylitol and (b) maltitol columns Mobile phases: acetonitrile/20 mmol/L ammonium acetate (95/5,v/v) for Fig. 5a and acetonitrile/20 mmol/L ammonium acetate (92/8,v/v) for Fig. 5b,pH 4.2; flow rate: 1 mL/min; injection volume: 5 μ L; detection: UV at 254 nm; temperature: 25 ℃.1. thymine; 2. uracil; 3. thymidine; 4. uridine; 5. adenosine; 6. adenine; 7. cytosine; 8. cytidine; 9. guanine; 10. guanosine.

图6

Fig. 6

图6 淫羊藿及其类似物在(a)木糖醇和 (b)麦芽糖醇柱上的分离 Fig.6 Separation of icariin and its analogues on (a) xylitol and (b) maltitol columns Mobile phase: acetonitrile/40 mmol/L ammonium acetate (92/8,v/v),pH 4.2; flow rate: 1 mL/min; injection volume: 5 μ L; detection: UV at 270 nm; temperature: 25 ℃.1. icariin; 2. epimedin B; 3. epimedin C; 4. epimedin A1; 5. epimedin A.

对于大多数测试化合物,木糖醇柱和麦芽糖醇柱表现出大致相同的选择性,只有维生素C在木糖醇柱上先于维生素B3洗脱,而在麦芽糖醇柱上后于维生素B3洗脱(见图3)。同时麦芽糖醇柱表现出对水杨苷独特的选择性,在相同的色谱条件下,水杨苷在木糖醇柱上的洗脱顺序位于水杨酸和对氨基水杨酸之间,在麦芽糖醇柱上却在对氨基水杨酸之后,甚至落后于乙酰水杨酸(见图4)。考虑到非线形的麦芽糖醇分子比线形的木糖醇分子在化学结构上多一个环状的糖基,同时维生素C和水杨苷在化学结构上也恰恰比同组化合物多一个环状(类)糖基结构,据此推测上述两点选择性的差异很可能来源于麦芽糖醇上的糖基和分析物的糖基之间强烈的氢键作用。这种推测可以进一步地被碱基及其相应的核苷的分离结果证明:核苷相对于其相应的碱基在分子结构上仅多一个环状糖基,以直链形的木糖醇柱为标准,选择因子 α _maltitol/ α _xylitol的计算值(见表1)均大于1。类似地,表1中淫羊藿苷及其类似物的 α _maltitol/ α _xylitol计算值均大于1,也同样证明麦芽糖醇柱对环状糖基独特的选择性。此外,碱基及其相应的核苷在木糖醇和麦芽糖醇固定相上的洗脱顺序明显不同于其他多羟基型固定相^{[24, 25, 29, 31, 32]},说明其具有独特的选择性。

表1

Table 1

表1(Table 1)

表1 一些化合物及其糖基衍生物在两种糖醇柱上的选择因子比较 Table 1 Comparison of selectivities of the analytes and its glycosyl derivatives on xylitol and maltitol columns Compound αxylitol αmaltitol αmaltitol/αxylitol Adenosine/adenine 0.74 0.94 1.27 Cytidine/cytosine 1.08 1.24 1.15 Guanosine/guanine 1.10 1.25 1.14 Uridine/uracil 1.78 1.87 1.05 Thymidine/thymine 1.32 1.39 1.05 Epimedin A/icariin 4.82 7.00 1.45 Epimedin A1/icariin 4.41 6.18 1.40 Epimedin B/icariin 2.83 3.54 1.25 Epimedin C/icariin 3.07 4.13 1.35 Chromatographic conditions as Fig. 5 and Fig. 6. α : selectivity factor.

表1 一些化合物及其糖基衍生物在两种糖醇柱上的选择因子比较 Table 1 Comparison of selectivities of the analytes and its glycosyl derivatives on xylitol and maltitol columns

通过改变流动相pH(4.2～6.8)考察其对糖醇柱保留的影响。木糖醇和麦芽糖醇键合基团均为中性基团,一般不会受流动相pH变化的影响,流动相pH主要影响固定相表面的残余硅羟基(pK_a≈4)和化合物的带电状态。一方面硅羟基会在较高的pH下逐渐解离而带有更多的负电荷,进而对带电的化合物产生越来越强的静电作用,另一方面化合物本身带电状态的改变会引起其亲水性的变化。如图7所示,在考察的pH范围内,流动相pH对木糖醇和麦芽糖醇柱的影响是相同的。当pH从4.2增大至6.8时,硅羟基和维生素C(pK_a=4.0)之间的静电斥力因电离程度的增加而增大,趋向于保留减弱,同时维生素C因进一步电离而导致亲水性增强,趋向于保留增加,由于前者的影响大于后者,总的结果是维生素C的保留减弱。pH对维生素B3和朝藿定B的影响与维生素C类似。相反的,维生素B6(pK_a=5.0)的保留会随着pH的增大而略有增加,这是因为一方面硅羟基的进一步电离有助于增加静电引力,另一方面维生素B6的电离会趋向于静电引力和亲水性的减弱,从实验结果来看前一方面的原因略占优势。pH对腺苷的影响与维生素B6类似。对于水杨酸类化合物,pH的增大会促进其电离,一方面增强了与硅羟基的静电斥力,另一方面增加了化合物的亲水性,对于水杨酸和对氨基水杨酸,前者的影响稍强于后者,故其保留略有减弱;而对于3,4-二羟基苯乙酸,前者的影响远不及后者,因而保留显著增加。另外,通过比较不同pH下淫羊藿类似物的 α _maltitol/ α _xylitol值(见表2),发现随着流动相pH的增加,麦芽糖醇柱对糖基的选择性会有一定程 度的增强。此外,流动相pH的变化可以有效地改 善糖醇柱的分离效果,如图3a和3b所示,维生素B2和B6的分离度随pH的减小而稍有增加。

图7

Fig. 7

图7 (a)木糖醇和(b)麦芽糖醇柱上流动相pH对化合物色谱保留的影响 Fig.7 Effect of mobile phase pH for the retention factors of the analytes on (a) xylitol and (b) maltitol columns Mobile phase: acetonitrile/20 mmol/L ammonium acetate (90/10,v/v); flow rate: 1 mL/min; injection volume: 5 μ L; detection: UV at 254 nm; temperature: 25 ℃.

表2

Table 2

表2(Table 2)

表2 流动相pH对糖基在麦芽糖醇柱上保留的影响 Table 2 Effect of mobile phase pH for the retention of glycosyl on the maltitol column Glycosyl αmaltitol/αxylitol pH 4.2 pH 5.0 Epimedin B/icariin 1.24 1.27 Epimedin C/icariin 1.32 1.34 Epimedin A1/icariin 1.38 1.42 Epimedin A/icariin 1.43 1.47 Mobile phase: acetonitrile/20 mmol/L ammonium acetate (92/8,v/v); flow rate: 1 mL/min; injection volume: 5 μ L; detection: UV at 270 nm; temperature: 25 ℃.

表2 流动相pH对糖基在麦芽糖醇柱上保留的影响 Table 2 Effect of mobile phase pH for the retention of glycosyl on the maltitol column

通过增加流动相中乙酸铵的浓度(5～40 mmol/L )考察缓冲盐浓度对保留的影响。如图8所示,在两种糖醇柱上缓冲盐浓度对化合物保留的影响是相同的,即化合物的保留均随着缓冲盐浓度的增加而增强。

图8

Fig. 8

图8 (a)木糖醇和(b)麦芽糖醇柱上缓冲盐浓度 对化合物保留的影响 Fig.8 Effect of buffer salt concentration for the retention of analytes on (a) xylitol and (b) maltitol columns Mobile phase: acetonitrile/ammonium acetate (90/10,v/v),pH 6.8; flow rate: 1 mL/min; injection volume: 5 μ L; detection: UV at 254 nm; temperature: 25 ℃.

一般来说,流动相中缓冲盐浓度的增加一方面会引起吸附在固定相表面的水化层变厚而趋向于保留增强,另一方面也会引起更多的铵离子吸附在硅羟基表面,进而降低了硅羟基的平均带电量,导致其对分析物的静电斥力(或引力)减弱,趋向于保留增强(或减弱)。在糖醇柱上,对于中性的水杨苷来说,保留增强源于水化层的变厚;对于带负电的化合物如朝藿定B、对氨基水杨酸和维生素C来说,保留增强是水化层增厚和静电斥力减弱共同作用的结果;对于带正电的化合物如维生素B2和尿嘧啶来说,水化层增厚的影响大于静电引力减小的影响,总的作用结果仍是保留增强。另外,通过比较不同乙酸铵浓度下淫羊藿类似物的 α _maltitol/ α _xylitol值(见表3),发现随着缓冲盐浓度的增加,麦芽糖醇柱对糖基的选择性变化不明显。此外,利用流动相中缓冲盐浓度的变化同样可以很好地改善糖醇柱的分离效果,甚至改变其选择性,如图4b和4c所示,在麦芽糖醇柱上水杨酸类化合物的分离度均随着乙酸铵浓度的增大而显著增加,洗脱顺序也会发生部分改变。

表3

Table 3

表3(Table 3)

表3 缓冲盐浓度对糖基在麦芽糖醇柱上保留的影响 Table 3 Effect of buffer salt concentration for the retention of glycosyl on the maltitol column Glycosyl αmaltitol/αxylitol 5 mmol/L 20 mmol/L Epimedin B/icariin 1.25 1.23 Epimedin C/icariin 1.34 1.29 Epimedin A1/icariin 1.40 1.36 Epimedin A/icariin 1.46 1.40 Mobile phase: acetonitrile/ammonium acetate (92/8,v/v),pH 6.8; flow rate: 1 mL/min; injection volume: 5 μ L; detection: UV at 270 nm; temperature: 25 ℃.

表3 缓冲盐浓度对糖基在麦芽糖醇柱上保留的影响 Table 3 Effect of buffer salt concentration for the retention of glycosyl on the maltitol column