ACQUITY超高效液相色谱-质谱系统,配二极管阵列检测器和串联四极杆质谱检测器(美国Waters公司); AG285型精密电子天平(瑞士Mettler Toledo公司); 5810R型高速冷冻离心机(德国Eppendorf公司); Milli-Q超纯水系统(美国Millipore公司); KQ-100DE型数控超声波清洗器(昆山超声仪器有限公司)。

甲醇和乙腈为色谱纯,购自德国Merck公司;甲酸为分析纯,购自Sigma-Aldrich公司;实验用水为Milli-Q制备的超纯水;绿茶(西湖龙井,杭州茶厂有限公司)和红茶(滇红茶,云南省凤庆县佰艺茶厂)购自当地超市;标准品槲皮素-3-葡萄糖-鼠李糖 二糖糖苷(Q-GRh)、槲皮素-3-半乳糖糖苷(Q-Ga)、槲皮素-3-葡萄糖糖苷(Q-G)、山柰素-3-葡萄糖-鼠李糖二糖糖苷(K-GRh)、山柰素-3-葡萄糖糖苷(K-G)购自Sigma-Aldrich公司。

准确称取Q-GRh标准品,加入甲醇超声溶解,配制 1000 mg/L 的母液;用50%(v/v)甲醇水溶液稀释上述母液,配制质量浓度分别为0.1、0.2、0.5、1.0和2.0 mg/L 的系列标准工作溶液。

取适量绿茶及红茶,粉碎,过筛(筛孔尺寸:0.9 mm×0.9 mm),精确称取筛下物1.5 g于50 mL带盖螺口玻璃试管中,分别加入30 mL 80%(v/v)甲醇水溶液,超声萃取15 min,以 4000 r/min 离心15 min,取上清液1 mL,加入4 mL水稀释,稀释液用0.22 μ m聚四氟乙烯(PTFE)针式过滤器过滤后供UPLC-PDA-MS/MS分析,每个样品平行制备两份。

Waters ACQUITY UPLC HSS T3色谱柱(150 mm×2. 1 mm,1.7 μ m);柱温为35 ℃;自动进样器温度为15 ℃;紫外检测波长为370 nm;进样体积为2 μ L;流动相A为含0.1%(v/v)甲酸的水溶液;流动相B为含0.1%(v/v)甲酸的乙腈;流速为0.3 mL/min。梯度洗脱程序:0～1 min,0.1%B; 1～2 min,0.1%B～0.3%B; 2～3 min,0.3%B～0.5%B; 3～4 min,0.5%B～2%B; 4～5 min,2%B～5%B; 5～8 min,5%B～15%B; 8～12 min,15%B～17%B; 12～15 min,17%B～24%B; 15～17 min,24%B～26%B; 17～20 min,26%B～35%B; 20～21 min,35%B～60%B; 21～22 min,60%B～95%B; 22～23 min,95%B; 23～23.1 min,95%B～0.1%B; 23.1～26 min,0.1%B。

采用电喷雾离子(ESI)源,正离子模式;毛细管电压为3.0 kV,离子源温度为150 ℃;脱溶剂气(氮气)温度为400 ℃;雾化气(氮气)流速为600 L/h,锥孔气(氮气)流速为50 L/h,碰撞气(氩气)流速为0.13 mL/min;在化合物的定性识别中,对各目标组分进行子离子扫描,扫描范围为m/z 100～900,碰撞电压为35 V,裂解电压为12 V;在化合物的定量分析中,采用多反应监测(MRM)方式,母离子均为加氢离子[M+H]⁺,子离子均为脱糖苷的苷元离子，杨梅素糖苷类化合物的子离子均为m/z 319，槲皮素糖苷类化合物的子离子均为m/z 303，山柰素糖苷类化合物的子离子均为m/z 287。

茶叶成分复杂,对茶汤滋味和色泽起重要作用的非挥发性组分包含糖类、氨基酸类、有机酸类、儿茶素类、黄酮醇糖苷类、茶黄素类等化合物,为了有效地进行组分分离,应当选择较长的色谱柱。实验中采用粒径为1.7 μ m、柱长为150 mm的色谱柱,各组分得到了较好的分离;实验也比较了流动相的有机相分别为甲醇和乙腈的洗脱情况,对选定的色谱柱,使用甲醇洗脱时系统压力超过69 MPa,因此实验中采用乙腈进行洗脱。在优化的色谱条件下,选定的黄酮醇糖苷类化合物在12～18.5 min之间全部洗脱出来,对应的色谱图见图2,各组分的保留时间见表2。

图2

Fig. 2

图2 绿茶和红茶中15种黄酮醇糖苷类化合物的色谱图(检测波长：370 nm) Fig.2 UPLC chromatograms of the 15 flavonol glycosides in green tea and black tea (detection wavelength: 370 nm) Peak identifications: 1. M-GRh; 2. M-Ga; 3. M-G; 4. Q-GaRhG; 5. Q-GRhG; 6. Q-GaRh; 7. Q-GRh; 8. K-GaRhG; 9. Q-Ga; 10. Q-G; 11. K-GRhG; 12. K-GaRh; 13. K-GRh; 14. K-Ga; 15. K-G.

表2

Table 2

表2(Table 2)

表2 绿茶和红茶中黄酮醇糖苷类化合物的含量(n=2) Table 2 Contents of flavonol glycosides in green tea and black tea (n=2) Peak No. in Fig. 2 Compound Formula Exact mass tR/min Diagnostic fragments (m/z) Green tea (mean±SD)/(mg/kg) Black tea (mean±SD)/(mg/kg) 1 M-GRh C27H30O17 626.1483 12.55 627/465/319 108.2±3.8 2.3±0.1 2 M-Ga C21H20O13 480.0904 12.76 481/319 705.1±15.5 11.7±0.5 3 M-G C21H20O13 480.0904 13.03 481/319 593.8±18.4 17.1±0.6 4 Q-GaRhG C33H40O21 772.2062 13.38 773/611/465/303 732.1±22.0 33.0±0.7 5 Q-GRhG C33H40O21 772.2062 13.86 773/611/465/303 920.5±13.8 111.1±3.9 6 Q-GaRh C27H30O16 610.1534 14.48 611/465/303 48.0±2.4 213.0±8.5 7 Q-GRh C27H30O16 610.1534 14.66 611/465/303 196.4±3.9 677.2±19.6 9 Q-Ga C21H20O12 464.0955 14.98 465/303 431.5±8.2 291.1±4.1 10 Q-G C21H20O12 464.0955 15.22 465/303 311.5±5.0 693.6±6.9 8 K-GaRhG C33H40O20 756.2113 14.66 757/595/449/287 1174.3±10.6 37.7±1.4 11 K-GRhG C33H40O20 756.2113 15.29 757/595/449/287 1685.9±8.4 341.4±9.9 12 K-GaRh C27H30O15 594.1585 15.51 595/449/287 74.5±2.8 135.0±3.8 13 K-GRh C27H30O15 594.1585 15.99 595/449/287 255.2±10.7 1031.0±11.3 14 K-Ga C21H20O11 448.1006 16.07 449/287 338.8±8.1 867.4±14.7 15 K-G C21H20O11 448.1006 16.51 449/287 472.7±15.6 165.6±4.1

表2 绿茶和红茶中黄酮醇糖苷类化合物的含量(n=2) Table 2 Contents of flavonol glycosides in green tea and black tea (n=2)

对茶叶中黄酮醇糖苷类化合物的识别尽量通过相应的标准品进行比对确认,如色谱保留时间、一级和二级质谱等参数;对无法得到市售标准品的一些化合物,参考紫外吸收光谱,通过相对分子质量及二级质谱碎片离子进行结构解析,与其结构相似的化合物进行比较,并与参考文献进行比对确认。

如峰7、9、10、13和15,其色谱保留时间、相对分子质量和二级质谱碎片离子在相同的实验条件下,均与其对应的标准品相似,因此可分别识别为Q-GRh、Q-Ga、Q-G、K-GRh和K-G。

峰1、2和3,其对应的分子离子峰[M+H]⁺分别为m/z 627、481和481,初步判断为M-GRh、M-Ga和M-G,测定的相对分子质量与其理论相对分子质量相匹配;峰1的特征子离子碎片为m/z 465和319,分别为失去葡萄糖的碎片离子[M-G]⁺和失去芸香糖(葡萄糖+鼠李糖)的碎片离子[M-G-Rh]⁺;峰2和峰3的特征子离子碎片为m/z 319,为失去半乳糖的碎片离子[M-Ga]⁺或失去葡萄糖的碎片离子[M-G]⁺。对黄酮醇糖苷化合物中含有葡萄糖或半乳糖的异构体,在反相液相色谱分离中,一般含半乳糖的黄酮醇糖苷化合物的色谱保留时间小于含葡萄糖的黄酮醇糖苷化合物的保留时间^{[4, 12, 13, 15, 16, 17]},因此可识别峰2和3分别为M-Ga和M-G。

峰14的分子离子峰[M+H]⁺为m/z 449,初步判断为K-Ga,且测定的相对分子质量与其理论相对分子质量相匹配;其特征子离子碎片m/z 287,为失去半乳糖的碎片离子[M-Ga]⁺,且一级和二级质谱参数与其异构体K-G一致,色谱保留时间小于K-G,由此得到确认。相应的,峰12和6的分子离子峰[M+H]⁺分别为m/z 595和611,其特征的子离子碎片分别为m/z 449/287和m/z 465/303,分别为失去鼠李糖的碎片离子[M-Rh]⁺(m/z 449/465)和失去半乳糖及鼠李糖的碎片离子[M-Ga-Rh]⁺(m/z 287/303),并且二级质谱参数与其异构体K-GRh/G-GRh极其相识,初步判断峰12和峰6分别为K-GaRh和G-GaRh,且测定的相对分子质量与其理论相对分子质量相匹配。

峰4/5和8/11,其对应的分子离子峰[M+H]⁺分别为m/z 773/773和757/757,初步判断为槲皮素三糖糖苷(Q-GaRhG/Q-GRhG)和山柰素三糖糖苷(K-GaRhG/K-GRhG),且测定的相对分子质量分别与其理论相对分子质量相匹配;峰4/5和8/11,其特征的子离子碎片为m/z 611/465/303和595/449/287,其中碎片m/z 611和595分别为槲皮素三糖糖苷及山柰素三糖糖苷失去一分子葡萄糖的碎片离子[M-G]⁺或失去一分子半乳糖的碎片离子[M-Ga]⁺;碎片m/z 465和449分别为槲皮素三糖糖苷及山柰素三糖糖苷失去一分子葡萄糖和一分子鼠李糖的碎片离子[M-GRh]⁺或失去一分子半乳糖和一分子鼠李糖的碎片离子[M-GaRh]⁺;碎片m/z 303和287分别为槲皮素三糖糖苷及山柰素三糖糖苷失去两分子葡萄糖和一分子鼠李糖的碎片离子[M-GRhG]⁺或失去一分子半乳糖、一分子鼠李糖和一分子葡萄糖的碎片离子[M-GaRhG]⁺。以Q-GRhG为例,其对应的二级子离子谱图如图3所示,m/z 773为分子离子峰[M+H]⁺,m/z 611为[M-G]⁺碎片离子,m/z 465为[M-GRh]⁺碎片离子,m/z 303为[M-GRhG]⁺碎片离子。

图3

Fig. 3

图3 Q-GRhG的二级质谱图 Fig.3 MS/MS spectrum of Q-GRhG

如表1所示,黄酮醇糖苷类化合物连接不同种类及数量的糖苷,因此其色谱保留差异显著。由于糖链中的羟基具有极性,三糖糖苷类化合物的极性最大,在反相液相色谱中其保留最弱,其次为二糖糖苷,最后为单糖糖苷类化合物。对杨梅素、槲皮素及山柰素糖苷类化合物,均有类似的色谱保留规律,如M-GRh＜M-Ga＜M-G,Q-GaRhG＜Q-GRhG＜Q-GaRh＜Q-GRh＜Q-Ga＜Q-G,K-GaRhG＜K-GRhG＜K-GaRh＜K-GRh＜K-Ga＜K-G。另外,在黄酮醇母体结构的B环中,杨梅素有3个羟基,槲皮素有2个羟基,山柰素有1个羟基,因此,总体来讲,杨梅素、槲皮素及山柰素糖苷类化合物的保留时间递增;同时,对于糖苷类型相同的3种黄酮醇糖苷化合物,其保留时间有如下规律:M-G(M-Ga)＜Q-G(M-Ga)＜K-G(M-Ga),M-GRh ＜Q-GRh＜K-GRh,Q-GaRh＜K-GaRh,Q-GRhG(Q-GaRhG)＜K-GRhG(K-GaRhG)。其次,如前所述,含有葡萄糖或半乳糖的黄酮醇糖苷异构体化合物,含半乳糖的黄酮醇糖苷异构体的保留时间小于含葡萄糖的黄酮醇糖苷异构体的保留时间,可由槲皮素单糖糖苷的标准品进行证明,即Q-Ga＜Q-G;因此,在同分异构体化合物,如峰2/3、4/5、6/7、8/11、12/13以及峰14/15的识别过程中,均认定保留时间较小的为含半乳糖的黄酮醇糖苷化合物。

由于不易获得市售的黄酮醇糖苷类标准品,文献中对其定量多数采用相对定量的方法,如Price等^[4]采用紫外检测方法,以黄酮醇苷元槲皮素和山柰素为标准品,对其他黄酮醇糖苷进行相对定量。由于茶叶组成化学成分复杂,各黄酮醇糖苷类化合物之间以及与其他干扰成分之间不能完全分离,并且茶叶中黄酮醇糖苷类化合物含量较低,特别是槲皮素和山柰素等游离苷元的含量非常低,在紫外检测方法定量中以此作为标准品对其他黄酮醇糖苷的定量会造成较大的误差。鉴于质谱的高灵敏度和高选择性,同时由于本文研究的几种黄酮醇糖苷的同分异构体化合物均具有良好的色谱分离性能,因此,本文采用MRM方式进行定量,母离子均采用加氢离子峰[M+H]⁺,子离子均为脱糖苷的苷元离子。

由于一些黄酮醇糖苷化合物无市售的标准品,本文采用相对定量的方法,即以Q-GRh为标准品,配制不同浓度的标准工作溶液,外标法准确定量茶叶中的Q-GRh含量;茶汤中其他黄酮醇糖苷类化合物的含量根据各自的峰面积和茶叶中Q-GRh的峰面积和含量进行确定(见式(1))。

式(1)中，C_j表示茶汤中其他黄酮醇糖苷化合物的含量,C_i表示茶汤中Q-GRh的含量;A_j表示茶汤中其他黄酮醇糖苷化合物的峰面积,A_i表示茶汤中Q-GRh的峰面积;M_j表示其他黄酮醇糖苷化合物的相对分子质量,M_i表示Q-GRh的相对分子质量;F_j表示其他黄酮醇糖苷化合物相对于Q-GRh的摩尔响应系数。由于无法得到所有黄酮醇糖苷类化合物的标准品,无法准确测定黄酮醇糖苷类化合物的质谱响应差异,因此本文均假定其他黄酮醇糖苷化合物的质谱响应与Q-GRh一致,即各黄酮醇糖苷类化合物的F_j均等于1。

同时考虑茶汤样品制备及稀释的影响,茶叶中黄酮醇糖苷类化合物的含量按式(2)进行计算。

式(2)中，C_j′表示茶叶中黄酮醇糖苷类化合物的含量，W表示样品的质量,V表示萃取液的体积,D表示进样前的稀释倍数,C_j表示茶汤中黄酮醇糖苷类化合物的含量。

对1.2.2节制备的绿茶及红茶样品,采用1.2.3节及1.2.4节的色谱-质谱方法进行分析,采用2.3节的定量方法进行计算,绿茶及红茶中黄酮醇糖苷类化合物的含量如表2所示,结果以两次测定的平均值及标准偏差(SD)来表示。

由表2可知,绿茶和红茶中黄酮醇糖苷类化合物的含量并不一致,其含量分布如图4所示。绿茶中黄酮醇糖苷类化合物的总量为 8048.6 mg/kg,红茶中黄酮醇糖苷类化合物的总量为 4628.3 mg/kg,绿茶中的黄酮醇糖苷总量是红茶的1.7倍。Wu等^[7]指出,除茶叶品种外,茶叶生长环境、采摘时间、加工工艺、贮藏条件等都会对茶叶中黄酮醇糖苷类化合物的分布和含量有一定的影响。绿茶中含量较高的黄酮醇糖苷类化合物是M-Ga、M-G、Q-GaRhG、Q-GRhG、K-GaRhG和K-GRhG,其含量 占总黄酮类化合物的72.2% ,而红茶中含量较高的黄酮醇糖苷类化合物是Q-GRh、Q-G、K-GRh和K-Ga,其含量占总黄酮的70.6% 。

图4

Fig. 4

图4 绿茶和红茶中黄酮醇糖苷化合物的含量分布 Fig.4 Content distributions of flavonol glycosides in green tea and black tea

绿茶和红茶中杨梅素总糖苷、槲皮素总糖苷和山柰素总糖苷的含量分布也不尽相同。在绿茶中，杨梅素总糖苷、槲皮素总糖苷和山柰素总糖苷的含量分别占总黄酮醇糖苷含量的17.5% 、32.8%和49.7% ；在红茶中，其比例分别为0.7% 、43.6%和55.7% 。结果如图5所示。

图5

Fig. 5

图5 绿茶和红茶中杨梅素、槲皮素及山柰素单糖糖苷、二糖糖苷及三糖糖苷总量的分布 Fig.5 Distributions of mono-glycosides (mG),di-glycosides (dG) and tri-glycosides (tG) of myricetins (M), quercetins (Q) and kaempferols (K) in green tea and black tea

绿茶和红茶中黄酮醇单糖糖苷、二糖糖苷及三糖糖苷以及各种黄酮醇糖苷类化合物的含量分布也有差异。绿茶和红茶中杨梅素黄酮醇单糖糖苷总量占其杨梅素总糖苷的比例基本一致,均为92.5%左右;绿茶和红茶中二糖糖苷占其杨梅素总糖苷的比例也大致相同,约占7.5% 。对于槲皮素黄酮醇糖苷,绿茶和红茶中单糖糖苷总量、二糖糖苷总量及三糖糖苷总量分别占其槲皮素总糖苷的比例相差较大,如绿茶中,二糖糖苷总量占到槲皮素总糖苷的9.3% ,三糖糖苷总量占62.6% ;而红茶中,两者的比例分别为44.1%和7.1% ;显示出较大的差异。对于
山柰素黄酮醇糖苷,绿茶和红茶中单糖糖苷总量、二糖糖苷总量及三糖糖苷总量的分布也有相似的特点。虽然黄酮醇类化合物的个体含量差异巨大,但在绿茶或红茶中,槲皮素单糖糖苷总量占其槲皮素总糖苷的比例以及山柰素单糖糖苷总量占其山柰素总糖苷的比例基本一致,在绿茶中其比例分别为28.1%和20.3% ,在红茶中其比例分别为48.8%和40.1% ;槲皮素和山柰素二糖糖苷总量及三糖糖苷总量占其总糖苷的比例在绿茶或红茶中的分布也有类似的规律,如槲皮素和山柰素二糖糖苷总量占糖苷的比例在绿茶中分别为9.3%和8.2% ,在红茶中分别为44.1%和45.2% ;槲皮素和山柰素三糖糖苷总量占糖苷的比例在绿茶中分别为62.6%和71.5% ,在红茶中分别为7.1%和14.7% 。

本文建立了超高效液相色谱-二极管阵列检测-串联四极杆质谱测定茶叶中黄酮醇糖苷类化合物的方法。通过与标准品比对、色谱保留规律的探讨以及一级和二级质谱碎片离子的结构解析,鉴定了绿茶和红茶中的15种黄酮醇糖苷类化合物,包括3种杨梅素糖苷、6种槲皮素糖苷和6种山柰素糖苷类化合物。含量测定采用串联四极杆质谱检测方法,以Q-GRh为标准品外标法进行定量,其他黄酮醇糖苷以Q-GRh为标准品进行相对定量。结果表明绿茶和红茶中黄酮醇糖苷类化合物的含量和分布差异显著,所建立的方法可以快速鉴定和测定茶叶中的黄酮醇糖苷类化合物,对茶叶化学成分研究、制茶工艺改进、茶汤滋色研究、黄酮醇糖苷类化合物的制备及其功效研究等具有重要意义。