美国Waters Xevo TQ三重四极杆质谱仪(Waters公司);瑞典CMA微透析取样系统,包括CMA 402双通道微透析泵、MAB85双通道冷却收集器、MAB6脑探针及导引管,以及动物五通道清醒活动装置(美国Instech公司);动物手术设备:CMA450动物体温控制器、美国ASI SAS-4100单臂脑立体定位仪、颅钻(深圳沃瑞德科技有限公司); BS l10S分析天平(北京赛多利斯有限公司); Milli-Q超纯水仪;Eppendorf 5810R高速冷冻离心机(德国Eppendorf公司);超声波清洗器(昆山超声仪器公司); XW-80A漩涡混匀器(上海精科实业有限公司);雷兹pH计。

L-DOPA和DA(Sigma公司);乙腈、甲醇、甲酸均为色谱纯(Sigma公司);碳酸钠、碳酸氢钠等为分析纯;同位素衍生化试剂d₀/d₃-MASC(纯度99% )自主合成^[13];水为Millipore纯水系统制备。

按实验要求称取适量d₀/d₃-MASC,用乙腈配成1.0×10^-3mol/L的溶液。分别称取适量L-DOPA和DA标准品,用50%(v/v)乙腈水溶液配成0.01 mol/L 储备液,稀释得系列工作液。Na₂CO₃-NaHCO₃缓冲液(0.1 mol/L)经纯水配制后用NaOH溶液精密调节pH至10.8。

雄性SD大鼠(200～220 g),购自山东鲁抗医药有限公司实验动物中心,动物手术、PD动物模型和微透析探针手术技术按照王丹巧研究组^[3]报道的方法开展实验,脑内注射6-羟基多巴胺(6-OHDA)造模,分为正常组、PD模型组、PD+L-DOPA组、PD+L-DOPA+首乌方高剂量组(PD+L-DOPA+high SWF,生药量18 g/(kg·d))、PD+L-DOPA+首乌方低剂量组(PD+L-DOPA+low SWF,生药量8 g/(kg·d)),每组6只。微透析灌流速度2.0 μ L/min,平衡60 min后开始收集透析液,每15 min自动收集1管用于后续检测。

在1.5 mL离心管中加入100 μ L d₀-MASC溶液、适量混合标准溶液(或大鼠脑微透析液样本,20～50 μ L)、100 μ L Na₂CO₃-NaHCO₃缓冲液,混匀后37 ℃下恒温衍生反应3.0 min即可完全标记,加入10 μ L 25%(v/v)甲酸水溶液调pH至弱酸性。在第二支离心管中,采取同样的方式,用d₃-MASC标记另一份混合标准溶液或微透析液样品,标记流程示意图见图1。

图1

Fig. 1

图1 L-DOPA和DA的稳定同位素编码衍生和分散液液微萃取示意图 Fig.1 Procedure scheme of stable isotope-coded derivatization and dispersive liquid-liquid microextraction of L-DOPA and DA

将上述两支离心管中的标记产物合并至一支10 mL尖底离心管中,加水至8 mL,以400 μ L甲醇为分散剂,160 μ L氯仿为萃取剂,室温下超声振荡萃取3.0 min,10000 r/min高速离心3.0 min,吸取下层有机相，氮吹至干,50%(v/v)甲醇水复溶后用于检测。

色谱柱为UPLC BEH Shield RP 18柱(50 mm×2.1 mm,1.7 μ m,Waters公司)。流动相A为甲醇,流动相B为0.1%(v/v)甲酸水溶液。梯度洗脱条件: 0～2.0 min,65%A～100% A。流速0.5 mL/min,柱温30 ℃,进样量5 μ L。采用三重四极杆质谱的多反应监测(MRM)模式,电喷雾电离(ESI)源正离子模式,离子源温度150 ℃,毛细管电压3.0 kV,脱溶剂气(氮气)流速800 L/h、温度350 ℃,锥孔气(氮气)流速50 L/h,碰撞气(氦气)流速0.16 mL/min,锥孔电压、碰撞能、定量和定性离子对参数见表1。

表1

Table 1

表1(Table 1)

表1 L-DOPA和DA的d0/d3-MASC衍生物的质谱MRM采集参数 Table 1 Conditions of d0/d3-MASC derivatives of L-DOPA and DA in mass spectrometric MRM analysis Compound Retention time/min Cone voltage/V Quantitation transition (m/z) (collision energy/eV) Confirmation transition (m/z) (collision energy/eV) d0-MASC-L-DOPA 0.896 58 1011.35＞208.10 (54) 1011.35＞224.25 (56) d3-MASC-L-DOPA 0.896 58 1020.35＞211.10 (54) 1020.35＞227.25 (56) d0-MASC-dopamine 1.322 55 967.34＞208.10 (52) 967.34＞224.25 (54) d3-MASC-dopamine 1.322 55 976.34＞211.10 (52) 976.34＞227.25 (54)

表1 L-DOPA和DA的d0/d3-MASC衍生物的质谱MRM采集参数 Table 1 Conditions of d0/d3-MASC derivatives of L-DOPA and DA in mass spectrometric MRM analysis

参考许国旺研究组^[20]和本研究组^[15]的同位素编码标记定量法:两份等浓度混合标准溶液分别用d₀-MASC和d₃-MASC标记,将两份衍生溶液按体积比1/10、1/5、1/2、1/1、2/1、5/1、10/1混合之后进行UHPLC-MS/MS分析,以轻/重衍生化产物的质谱峰面积比值对体积比值进行线性回归曲线制作,获得轻/重衍生物的相对响应因子。微透析液和适宜浓度的标准溶液经轻/重编码标记后,按一定比例混合之后进行UHPLC-MS/MS分析,利用相对响应因子计算微透析液中两种分析物的含量。

L-DOPA和DA分子本身极性强,采用直接LC-MS检测时色谱保留弱、分离度较差,采用本研究实验部分梯度洗脱条件时,二者的保留时间均小于0.5 min。采用MASC衍生化技术,能够显著改善二者在反相色谱柱上的保留行为。经优化不同色谱柱(Agilent公司的Eclipse、Zorbax系列的50、100 mm长的超高效液相色谱柱,以及Waters BEH系列的50 mm超高效液相色谱柱)和流动相条件(甲醇、乙腈、水相是否有甲酸调节剂),发现酸性的甲醇/水体系配合Waters UPLC BEH Shield RP 18超高效液相色谱柱有较好的分离效果。如要在1.0 min左右完成分离检测,两种分析物的峰形、分离度欠佳,影响定量准确度。进一步优化梯度洗脱程序,当采用1.6节中梯度洗脱程序时,L-DOPA和DA衍生物在2.0 min内实现了完全分离,峰形良好,保留时间见表1。经实验对比发现,正离子模式的灵敏度显著高于负离子模式。在正离子模式下,发现毛细管电压在1.2～3.0 kV内逐渐增加时检测信号逐渐增强,实验选用3.0 kV。质谱仪脱溶剂气流速和温度影响不明显,采用脱溶剂气流速800 L/h、温度350 ℃能获得较好的实验结果。采用实验部分的质谱条件,优化了两种衍生产物的MRM参数(见表1)。L-DOPA和DA衍生物都能特异性地产生208.10 Da (重标211.10 Da)的产物离子,在酸性乙腈/水流动相体系中,该产物离子结构通过酮式-烯醇式互变,极易产生带一个正电荷的季铵型结构,因此产生L-DOPA和DA吖啶酮衍生物的质谱增敏结果。代表性的d₀-MASC-L-DOPA衍生物的MS/MS图、裂解模式及质谱增敏产物离子见图2。

图2

Fig. 2

图2 d0-MASC-L-DOPA的MS/MS图、特异性产物离子裂解模式及MS增敏机理 Fig.2 MS/MS spectrum,specific fragmentation scheme and MS sensitivity enhancement mechanism of d0-MASC-L-DOPA

采用MASC试剂标记L-DOPA和DA分子中的氨基和酚羟基,该衍生化反应的主要影响因素包括缓冲溶液pH、衍生化温度、时间、衍生化试剂倍数。参照以往MASC衍生化环境雌激素分子中酚羟基基团的方法与条件^[13]进行单因素法优化。首先考察缓冲液pH在8.0～11.0范围内对衍生反应的影响,pH 8.0～9.0时目标衍生化产物的仪器信号极低;pH＞9.0时信号随pH增大而逐渐提高;pH 10.8时达到最大值,之后仪器信号下降,这可能是因为强碱性导致衍生试剂和衍生物的分解更甚。因此实验选用pH 10.8的碳酸钠-碳酸氢钠缓冲液。同样考察MASC用量、衍生时间、温度变化规律。随MASC用量增加,衍生物的仪器信号逐渐增大;当MASC用量为两种分析物总物质的量的8倍时仪器信号最高。在衍生时间和温度方面,37 ℃下衍生3 min产物的信号最大。总之,实验最佳衍生化条件为:Na₂CO₃-NaHCO₃缓冲液(pH 10.8),37 ℃下衍生反应3 min,MASC物质的量为两种分析物总量的8倍。

UA-DLLME实验的主要影响因素包括萃取剂、分散剂的种类、用量以及超声时间。经实验优化发现,萃取剂、分散剂的种类和用量是影响萃取效率的最重要因素。选取5种萃取剂(氯苯、二氯乙烷、四氯化碳、三氯甲烷、二氯甲烷)和4种分散剂(甲醇、乙醇、乙腈、丙酮)进行分别交叉组合考察。实验结果表明,三氯甲烷作为萃取剂、甲醇作为分散剂时,不但易于离心分层,而且沉积相中萃取物的仪器响应信号最高,且分析方法回收率较好。因此,实验选择三氯甲烷作为萃取剂,甲醇作分散剂。考察萃取剂和分散剂的用量,当三氯甲烷160 μ L、甲醇400 μ L时,沉积相中萃取物的仪器信号响应值最高。采用以上最佳条件进行超声萃取时间的优化,发现超声振荡3.0 min可获得最高的仪器响应值。采用以上优化条件进行一次UA-DLLME后,吸净下层沉积相,再对上层溶液重复进行一次UA-DLLME和检测,未检出L-DOPA和DA衍生物。实验结果表明,建立的UA-DLLME条件对L-DOPA和DA衍生物的萃取效率满足分析方法要求。

采用优化的衍生化、UA-DLLME和色谱-质谱分析条件及定量方式,在0.20～1500.0 nmol/L 浓度范围内进行线性回归曲线制作,L-DOPA和DA衍生物的线性回归系数大于0.994,线性关系良好。L-DOPA、DA的检出限(S/N=3)分别为0.005、0.009 nmol/L,定量限(S/N=10)分别为0.020、0.036 nmol/L。

在上述实验条件下,在PD症大鼠脑微透析液中加标浓度分别为0.10、10.0 nmol/L 时制备MASC的衍生物,用于稳定性、精密度及准确度的考察。上述两个浓度水平的混合标准MASC衍生化产物溶液在室温下放置7天,分别于第1、3、5、7天测定峰面积，计算峰面积的RSD,在4.1% ～8.9%之间,表明L-DOPA和DA的MASC衍生产物稳定性良好,能够满足实验要求。同一日内连续进样5次、连续3日每日进样5次分别用于日内和日间精密度、准确度的考察,峰面积的RSD为3.0% ～9.1% ,精密度良好;添加物的检出浓度和理论浓度比值在89.5% ～104.9%之间,准确度良好。

考察PD症大鼠脑微透析液在0.10、10.0 nmol/L 加标水平下的回收率,结果为94.8% ～103.8%,表明方法回收率良好。按照(微透析液中添加的L-DOPA或DA质谱检测峰面积/纯水中等量添加物峰面积)×100%计算基质效应,结果为97.5% ～103.8%,表明同位素编码衍生化与DLLME联合使用的方法具有良好的抗基质干扰能力。

用本方法与神经递质分析方法领域的代表性研究^{[7, 10, 20, 21, 22]}进行比较。第一,与2种未经衍生的代表性的直接检测方法HPLC-电化学法^[20]和亲水作用色谱-质谱(HILIC-MS/MS)^[21]相比,本方法中两种分析物的LOD是其1/55～1/10944 ,分析时间短10或18 min。第二,与3种典型的衍生化LC-MS/MS检测方法相比,本方法的LOD是文献^{[7, 10]}的1/3～1/80,LOQ是文献^[22]的 1/1265 ,而且本方法的衍生化反应温度适合生物样本,衍生化时间缩短为原来的1/8～1/20,分离时间与文献相当^{[10, 22]}或更短^[7]。第三,在基质效应方面,用本方法与不采用同位素编码衍生技术(具体方法如下:只使用d₀-MASC衍生,UA-DLLME和质谱分析基本条件与本方法相同,定量方式采用文献^[17]中常规的外标法)进行对比,结果表明,本方法基质效应的平均值为98.9% 、标准偏差为3.4% ,显著优于只用d₀-MASC衍生的实验结果(基质效应的平均值为94.6% 、标准偏差为11.8% ),这说明同位素编码衍生化联合UA-DLLME技术能够显著降低基质干扰。

王丹巧研究组^[3]采用PD大鼠模型考察了中药方剂首乌方协同的L-DOPA药代动力学,发现在以较小剂量L-DOPA发挥较大药效作用方面,中药方剂首乌方具有良好的协同作用,但该报道未同时检测DA浓度受到的影响。本文利用该动物模型,进一步考察高、低剂量的首乌方与L-DOPA同时使用时对大鼠脑内纹状体L-DOPA和DA浓度的影响。按照实验部分的步骤,将采集得到的各组大鼠脑微透析液样本按照本法进行检测,结果表明,PD模型组大鼠纹状体DA含量显著低于正常组(p＜0.01),从生化分析层面证明本研究PD动物模型复制成功。表2为3组PD症大鼠给予西药、中西药结合(首乌方高、低剂量组)干预后的脑纹状体L-DOPA和DA的浓度结果。正常组、PD模型组、PD+L-DOPA+首乌方高剂量组的大鼠脑微透析液样品UHPLC-MS/MS (MRM)分析结果见图3,峰形、分离度良好,未发现干扰物质。实验结果表明,与PD+L-DOPA组相比,PD+L-DOPA+首乌方高、低剂量组纹状体细胞外液中L-DOPA和DA二者的浓度达到的最大值更低,且时间滞后,而且可以稳定纹状体L-DOPA药物及活性成分DA的浓度,使脑内二者浓度较长时间维持在有效水平,这些实验结果与首乌方高、低剂量具有相关性。这提示首乌方中的中药成分可延缓L-DOPA的代谢和消除,减小它们的浓度波动范围,以提高L-DOPA的疗效,减少副作用,该实验结果与文献^[3]中探讨的首乌方协同L-DOPA治疗PD的机制相同。

表2

Table 2

表2(Table 2)

表2 L-DOPA和DA在大鼠纹状体微透析液中浓度的动态变化(n=6) Table 2 Dynamic concentration changes of L-DOPA and DA in rat striatum microdialysate (n=6) t/min L-DOPA concentrations (mean±SD)/(μmol/L) DA concentrations (mean±SD)/(μmol/L) PD+L-DOPA group PD+L-DOPA+ high SWF group PD+L-DOPA+ low SWF group PD+L-DOPA group PD+L-DOPA+ high SWF group PD+L-DOPA+ low SWF group 0 0.128±0.024 0.119±0.028 0.122±0.032 0.018±0.006 0.020±0.007 0.017±0.006 15 0.473±0.095 0.193±0.045 0.338±0.069 0.030±0.010 0.024±0.004 0.025±0.008 30 1.290±0.216 0.614±0.132 0.971±0.156 0.045±0.008 0.030±0.008 0.038±0.015 45 1.810±0.358 0.724±0.156 1.070±0.268 0.066±0.011 0.038±0.009 0.049±0.019 60 1.670±0.301 0.769±0.168 1.250±0.259 0.181±0.035 0.120±0.019 0.141±0.032 75 1.300±0.266 0.816±0.162 1.100±0.265 0.255±0.064 0.142±0.036 0.164±0.038 90 1.030±0.189 0.665±0.135 0.978±0.197 0.235±0.053 0.150±0.039 0.197±0.049 105 0.768±0.136 0.524±0.106 0.843±0.165 0.183±0.045 0.160±0.042 0.173±0.039 120 0.646±0.102 0.410±0.085 0.603±0.123 0.145±0.036 0.140±0.036 0.142±0.036 135 0.496±0.089 0.391±0.078 0.522±0.106 0.098±0.028 0.122±0.028 0.120±0.030 150 0.249±0.065 0.347±0.072 0.469±0.095 0.060±0.019 0.100±0.020 0.095±0.025 165 0.240±0.060 0.308±0.066 0.380±0.078 0.045±0.015 0.089±0.021 0.080±0.023 180 0.236±0.058 0.289±0.058 0.287±0.058 0.030±0.009 0.080±0.018 0.068±0.016

表2 L-DOPA和DA在大鼠纹状体微透析液中浓度的动态变化(n=6) Table 2 Dynamic concentration changes of L-DOPA and DA in rat striatum microdialysate (n=6)

图3

Fig. 3

图3 大鼠脑微透析液中L-DOPA和DA d0/d3-MASC衍生物的UHPLC-MS/MS (MRM)色谱图 Fig.3 UHPLC-MS/MS (MRM) chromatograms of L-DOPA and DA derivatives of d0/d3-MASC in rat brain microdialysate

建立并验证了同时测定L-DOPA和DA的稳定同位素编码衍生-分散液液微萃取UHPLC-MS/MS分析方法,该方法具有灵敏、准确、快速、专属性强、抗基质干扰等特点,能有效监控不同组PD大鼠脑微透析液中L-DOPA药物和生物活性成分DA的含量,为PD相关的医学检验和药物筛选提供了一种技术手段。