安捷伦1200液相色谱系统(Agilent Technologies,Palo Alto,CA,USA),由G1322A脱气机、G1311A四元泵、G1329A自动进样器、G1315B DAD紫外检测器以及G1330B柱温箱组成。元素分析由Vario EL III Universal CHNOS Elemental Analyzer (Elementar,Germany)测得。

硅胶(粒径:5 μ m;孔径:10 nm;比表面积:300 m²/g)购自Welch Materials,Inc. (Maryland,US)。巯丙基三甲氧基硅烷(MPS)购自武汉大学有机硅新材料公司。N-三羟甲基甲基丙烯酰胺(NA)、安息香二甲醚、核苷和碱基、维生素(B1、B2、B3、B3-amide、B6、B12)购自阿拉丁试剂。烷基苯、甲醇(MeOH)、三乙胺、乙腈(ACN)、乙酸、乙酸铵和甲酸铵购自上海国药试剂厂。实验所用的蒸馏水均取自成都艾柯纯水仪。

利用巯基与乙烯基的“点击化学”反应合成了含多元醇的硅烷偶联剂,再将其引入到硅胶表面。图1为固定相的合成路径。

图1

Fig. 1

图1 三元醇丙烯酰胺(NAS)固定相的合成过程 Fig.1 Synthesis procedure of the N-acryloyltris(hydroxymethyl) aminomethane-bonded silica (NAS) stationary phase

首先制备了多元醇的硅烷偶联剂,合成方法如下:将MPS (15 mmol)、NA (15 mmol)、安息香二甲醚(0.3 mmol)放入20 mL的透明玻璃瓶中混合均匀。将玻璃瓶置于20 W的紫外灯(波长为365 nm)照射的环境下,磁力搅拌反应24 h。所得的透明液体即为多元醇功能化的硅烷偶联剂。

接着将合成的硅烷偶联剂与硅胶反应。具体合成方法如下:将所合成的硅烷偶联剂与5 g硅胶分散于30 mL无水甲苯中,N₂保护下130 ℃回流反应20 h后过滤,分别用甲苯、甲醇、水和丙酮洗涤3次,置于60 ℃真空环境下干燥过夜,备用。

填装:以甲醇作为淋洗剂,ACN/H₂O(70%/30% )混合液为匀浆剂,用装柱机在41 MPa压力下填装30 min,将所得的NAS填料填入150 mm×4.6 mm的不锈钢色谱柱中。

HPLC条件:流速为1 mL/min;柱温为35 ℃;检测波长为254 nm或230 nm;流动相为不同比例的有机溶剂与缓冲液的混合物。流动相使用前均经过过滤与超声脱气处理。所有的测定均重复两次以上。

我们对不同批次的NAS固定相进行了元素分析,结果如表1所示。N与S的存在证明了NA单体已成功引入到固定相表面,而不同批次间硅胶相似的元素组成则证明合成方法具有良好的重现性。

表1

Table 1

表1(Table 1)

表1 NAS填料的孔结构表征与元素分析结果 Table 1 Pore structure and elemental analysis of NAS stationary phase Sample Pore size/nm Surface area/(m2/g) Batch Elemental analysis N/% C/% H/% S/% NAS 8.8 152 1 1.14 9.73 1.69 2.61 2 1.18 9.77 1.72 2.59 3 1.10 9.64 1.65 2.56 Pure silica 9.7 295 1 ND ND 0.07 ND 2 ND ND 0.06 ND 3 ND ND 0.07 ND ND: not detected.

表1 NAS填料的孔结构表征与元素分析结果 Table 1 Pore structure and elemental analysis of NAS stationary phase

一直以来,关于HILIC的溶质保留机理存在较大争议，主流的观点分为两种。其中被大家广泛接受的是Alpert提出的分配机理^[1]。该观点认为在分离过程中,极性固定相的表面会吸附流动相的水分子,使其在固定相表面形成水层,约4% ～13%的硅胶孔体积会被水分子占据,而分析物会在水层与流动相之间达到一个分配平衡。基于这种机理的研究衍生出了如下的理论模型^[13]:

近年来随着亲水作用色谱的研究逐渐深入,一种新的多重保留机理被越来越多的人所接受^[15],其理论模型中保留因子与水含量之间的关系式为:

我们认为亲水色谱模式下的溶质保留机理的不确定性与分析物本身的理化特性以及亲水固定相结构的多样性分不开,分析物的结构与固定相的结构都会对两者之间的相互作用产生影响。为了考察所合成的多羟基固定相的溶质保留机理,我们选取了6种核苷为分析物,考察了它们在固定相上的保留与流动相中水含量之间的关系,并按照上述的3个方程对分析物的保留与水含量之间的关系进行了多重回归分析。如表2所示,分析物的保留因子与水含量之间的关系与方程(3)最为吻合,相关系数均大于0.99。因此,固定相对于溶质的保留是一种吸附与分配作用均存在的多重保留机理。

表2

Table 2

表2(Table 2)

表2 不同理论模型下NAS柱上分析物保留因子与流动相中水含量的线性相关系数 Table 2 Correlation coefficients of the retention factors of the tested analytes on the NAS columns and water ontent in mobile phase using different equations Analyte Correlation coefficients Eq. (1) Eq. (2) Eq. (3) Nicotinamide 0.9498 0.9488 0.9980 Cytosine 0.9760 0.9967 0.9973 Adenosine 0.9971 0.9818 0.9992 Uridine 0.9955 0.9848 0.9995 Cytidine 0.9814 0.9965 0.9999 2′-Deoxycytidine 0.9849 0.9955 0.9994

表2 不同理论模型下NAS柱上分析物保留因子与流动相中水含量的线性相关系数 Table 2 Correlation coefficients of the retention factors of the tested analytes on the NAS columns and water ontent in mobile phase using different equations

固定相的结构中包含短的疏水碳链以及极性多羟基基团,我们通过改变流动相中乙腈的含量来观察分析物的保留时间变化,以此来考察固定相的亲水性与疏水性。如图2所示,疏水性物质苯、甲苯、萘在乙腈含量较低时有较强的保留,证明了固定相可以在疏水模式下应用于这些弱极性化合物的分离。而在流动相中乙腈含量较高的情况下极性分析物的保留大大增强,证明固定相在此条件下具有较强的亲水性。由于固定相的这种特性,使其能同时应用于亲水与反相色谱两种模式。

图2

Fig. 2

图2 分析物的保留因子随流动相中乙腈含量变化的趋势图 Fig.2 Plots of k values of the analytes vs. ACN volume fraction in mobile phase Flow rate: 1.0 mL/min; UV detection wavelength: 254 nm.

流动相流速对塔板高度有着非常重要的影响^[16]。根据Van Deemter方程,塔板高度与流速之间存在如下的关系^[12]:

图3

Fig. 3

图3 反相与亲水色谱两种模式下固定相的Van Deemter曲线 Fig.3 Van Deemter plots on the NAS column in RPLC and HILIC mode Mobile phases: for RPLC,ACN/20 mmol/L ammonium acetate,pH 6.5 (10:90,v/v); for HILIC,ACN/20 mmol/L ammonium acetate,pH 6.5 (85:15,v/v). UV detection: 254 nm.