Waters Alliance高效液相色谱仪(Waters,Milford,MA,USA),包括2695分离单元、自动进样器、柱恒温系统和2489紫外检测器。乙腈为Merck公司(Darmstadt,Germany)产品,实验室用水来自Milli Q纯水净化系统(Billerica,MA,USA),甲酸、甲酸铵为Acros公司(Fair Law,NJ,USA)产品。万古霉素(vancomycin B)、desvancosaminyl vancomycin(DESV)、双去氯万古霉素(dedichloro vancomycin,DDCV)、crystalline degradation product (CDP-1)标准品均购自Toronto Research Chemicals Inc.(Brisbane,Toronto,Canada),去甲万古霉素(norvancomycin,NORV)购自中国食品药品检定研究院(北京)。

TSK gel Amide-80柱购自日本Tosoh公司。Atlantis HILIC柱购自Waters公司(Milford,MA,USA)。ZIC-HILIC购自Merck公司(Darmstadt,Germany)。Click Maltose柱为实验室自制。Venusil HILIC为北京艾杰尔公司产品。Click XIon为北京华谱新创科技有限公司产品。以上色谱柱规格均为150 mm×4.6 mm,5 μ m。

色谱柱温度设定为30 ℃,流动相流速为1.0 mL/min;流动相A为乙腈,B为水,C为100 mmol/L 甲酸铵(pH 3.2);梯度洗脱程序:保持10%C不变,0～30 min由10%B升至40%B;检测波长设定为254 nm。

使用三元流动相体系,保持C相缓冲盐恒定为10% ,通过调节A和B的比例改变乙腈含量。

配制100 mmol/L 甲酸铵,通过调节甲酸加入量使pH分别为3.2、4.2、5.0,使用三元流动相体系,等度洗脱,保持65%A和25%B不变,更换C相溶液。

使用三元流动相体系,保持65%A不变,通过调节B和C的比例改变缓冲盐浓度。

使用三元流动相体系,梯度洗脱程序:保持10%C不变,0～40 min由18%B升至23%B,40～50 min由23%B升至25%B。

万古霉素为发酵生产得到,同时还会产生大量的结构类似物,本文选取了万古霉素产品中较为常见的几个杂质,结构式如图1所示。NORV相较于万古霉素丢失一个甲基结构,DESV为万古霉素失去一个氨基糖单元,DDCV是万古霉素失去两个氯原子。CDP-1是万古霉素降解重排之后产生的杂质,其含有两个同分异构体,分别为CDP-1-M和CDP-1-m,该杂质会引发毒副作用,在万古霉素质量分析中需要严格控制。所选的杂质标准品极性都与万古霉素相近,以此考察亲水作用色谱法对结构类似物的选择性。

本文筛选了6种常见的亲水作用色谱柱,包括TSKgel Amide-80、Atlantis HILIC、ZIC-HILIC、Click Maltose、Venusil HILIC、Click XIon色谱柱,这些固定相包含了硅醇基、两性离子、酰胺、麦芽糖等不同键合相,能够提供不同的分离选择性。通过考察相同实验条件下对万古霉素及其杂质标准品的分离,获得保留特性,进而选择分离选择性好,亲水性强的色谱固定相。表1列举了不同色谱柱对万古霉素及主要杂质的色谱保留时间。从万古霉素及其杂质的保留看,所选择的6种色谱柱选择性类似,出峰顺序遵从极性从小到大的顺序。DESV比万古霉素少一个糖基,故极性减小,先出峰,而CDP-1重排后,相较于万古霉素多生成一个羧基,故极性增大,去甲万古霉素和去氯万古霉素均因为去掉非极性基团(如甲基、氯原子)而使整个分子极性增强。不同色谱柱的亲水性有所差别,从保留时间看,Atlantis HILIC保留最弱,Click XIon柱保留最强。CDP-1为一对同分异构体,只有ZIC-HILIC色谱柱在此条件下能将两个异构体完全分离,但其对万古霉素、去甲万古霉素和CDP-1的分离度明显不够。为使万古霉素和杂质能够有更充分的调节空间和最大的分离度,最后选择保留最强的Click XIon柱进行流动相条件的考察和优化。

表1

Table 1

表1(Table 1)

表1 万古霉素及其杂质在不同色谱柱上的保留时间 Table 1 Retention times of vancomycin and its related impurities on different columns min Amide-80 Atlantis HILIC ZIC-HILIC Click Maltose Venusil HILIC Click XIon VAN 21.99 11.73 18.71 19.20 16.58 22.32 NORV 22.24 11.78 20.03 20.58 17.32 23.34 DESV 15.08 6.51 11.54 12.48 14.20 16.73 DDCV 21.57 12.88 21.68 20.10 17.60 24.19 CDP-1 22.34 11.91 19.32 20.01 18.98 25.00 22.77 - 19.99 - - -

表1 万古霉素及其杂质在不同色谱柱上的保留时间 Table 1 Retention times of vancomycin and its related impurities on different columns

在亲水作用色谱模式下,乙腈/水比例对溶质的保留影响最大。研究保留值和乙腈含量的关系,对于理解万古霉素及其杂质在Click XIon柱上的色谱保留机理具有一定的指导意义。如图2所示,万古霉素及其杂质的保留均随乙腈含量的增加而增加,表现出典型的HILIC模式特征。同时,从图中各曲线的变化率看,该类物质的保留随乙腈含量变化幅度均较大,即表现出对乙腈含量的变化较为敏感,这可能与该类物质的分子较大有关。

图2

Fig. 2

图2 万古霉素及其杂质的保留因子随乙腈含量的变化图 Fig.2 Plots of retention factors of vancomycin and its related impurities versus acetonitrile content in the mobile phase

为进一步了解其保留机理,依据吸附机理保留值方程(1)^{[17, 18]},考察了ln k(k为化合物的保留因子)和ln C_B(C_B为水的体积分数)的关系。具体的回归系数见表2。从线性回归系数(R²)上看,除保留最弱的DESV的线性系数低于 0.9990,其余4个物质都能很好地用该方程进行拟合,就此推测万古霉素及其杂质在Click XIon色谱柱上的保留除分配作用以外,还存在与固定相之间的直接的相互作用,例如静电作用、氢键作用、偶极作用等。

表2

Table 2

表2(Table 2)

表2 万古霉素及其杂质基于方程(1)得到的回归结果 Table 2 Results of regression equations of vancomycin and impurities based on equation (1) Compound a b R2 VAN -4.4516 -6.2024 0.9998 NORV -4.5821 -6.5194 0.9990 DESV -3.2986 -4.3325 0.9986 DDCV -4.4656 -6.5562 0.9999 CDP-1 -4.3358 -6.6576 0.9991

表2 万古霉素及其杂质基于方程(1)得到的回归结果 Table 2 Results of regression equations of vancomycin and impurities based on equation (1)

流动相pH值对溶质的保留具有重要影响,万古霉素及其杂质带有多个极性官能团,流动相pH的改变会影响不同极性官能团的电离状态,进而改变其保留行为。在不同pH的流动相条件下,两性离子固定相Click XIon柱所带电性也会有所变化^[19]。采用65%乙腈,保持10 mmol/L 缓冲盐浓度,调节甲酸铵-甲酸缓冲盐体系的pH,分别考察了pH 3.2、4.2、5.0条件下的分离效果。如图3所示,除DESV外，万古霉素及其杂质的保留均随流动相pH的增加而增强。推测这是由于当pH增大时，固定相由正电性转为负电性，与万古霉素及其杂质的静电作用增强，故保留增强。DESV相较于其他化合物没有产生静电作用的氨基糖结构，故保留未受pH影响。这也进一步证实了万古霉素及其杂质在亲水作用色谱中是多种作用力下的保留机理。

图3

Fig. 3

图3 万古霉素及其杂质的保留因子随流动相pH的变化图 Fig.3 Plots of retention factors of vancomycin and its related impurities versus pH of the mobile phase

在亲水作用色谱中,缓冲盐的浓度会影响溶质的保留时间,也可能改变固定相对溶质的分离选择性。为了解缓冲盐浓度对万古霉素及其杂质保留和选择性的影响,考察了不同盐浓度下各物质的保留时间。由乙腈含量实验可知,万古霉素及其杂质在乙腈含量为65%时,保留时间适宜,且各杂质之间可得到较好的分离,故本研究采用65%乙腈。由于万古霉素及其杂质的保留随pH增加而增强,为了更好地反映盐浓度的影响,在静电作用力最弱的pH 3.2条件下开展实验,通过改变水相和盐相(100 mmol/L 甲酸铵,pH 3.2)比例,调节不同盐浓度。如图4所示,除CDP-1外,万古霉素及其杂质的保留随缓冲盐浓度变化不明显,这与大多数小分子样品在亲水作用色谱保留中所展现的保留值随盐浓度增大而增加的现象^[20]不一致,推测原因为万古霉素及其杂质与固定相的静电吸引作用随盐浓度增加而降低,刚好与由盐浓度增加导致的保留增强的作用相反,二者共同作用的结果为保留几乎没有发生明显变化。而随盐浓度的增加,杂质CDP-1的保留有所下降,推测其原因为CDP-1相较于万古霉素分子,重排后生成了一个羧基,致使CDP-1与固定相的静电吸引作用增加,当盐浓度增加时,削弱了其与固定相的离子交换作用,故保留有所降低。在对比不同盐浓度下万古霉素及其杂质的分离度和保留后,10 mmol/L 盐被认为是较适宜的盐浓度。

图4

Fig. 4

图4 万古霉素及其杂质保留因子随缓冲盐浓度的变化图 Fig.4 Plots of retention factors versus salt concentration in the mobile phase

通过以上对万古霉素及其杂质的亲水保留性质的研究可知,万古霉素及其杂质在两性离子色谱柱上的保留较好,其保留随乙腈含量、pH值变化较大,随盐浓度变化不大。根据万古霉素及其杂质的保留性质,优化分离方法,使万古霉素及其杂质能够在较短的时间内实现基线分离。图5为采用添加甲酸铵的流动相梯度条件下对万古霉素及主要杂质的分离。从图5可以看出,虽然万古霉素和几个主要杂质的分子差别较小,保留性质较为相近,但在当前优化的条件下仍可实现较好的分离。CDP-1为两个同分异构体,在该条件下,两个峰有一定的分离趋势,保留时间越长,二者的分离度越大;考虑到分析时间不宜过长,未继续延长时间改善其分离度。由于购买的杂质标准品纯度不高,仍可见其他杂质峰存在,均与万古霉素实现较好的分离,体现了亲水作用色谱在万古霉素与杂质的分离中具有一定的优势。同时,该方法采用了质谱兼容的乙腈-甲酸铵体系,可以直接用于对未知杂质的鉴定。但是,从峰形上看,万古霉素、去甲万古霉素和去氯万古霉素峰均存在一定程度的前伸,对分离效率和分离度造成不利影响。因此,HILIC固定相和方法仍需要进一步筛选和优化,以改善峰形和提高分离度。

图5

Fig. 5

图5 万古霉素及其杂质的HILIC谱图 Fig.5 HILIC chromatogram of vancomycin and its related impurities

本文以万古霉素及其4个常见杂质为研究对象,探索了万古霉素类抗生素的亲水作用色谱保留行为。通过对比万古霉素及其杂质在不同亲水键合色谱柱上的保留时间,选取了两性离子Click XIon色谱柱为固定相。通过考察流动相中有机相比例、盐浓度及pH值对万古霉素及其杂质保留的影响,初步探讨了该类物质的亲水保留机制及影响因素,并优化得到乙腈-甲酸铵(pH 3.2)的流动相体系,实现了万古霉素及其杂质的有效分离。亲水作用色谱方法分离万古霉素及其杂质,可以获得较好的保留和分离,质谱兼容性好,可弥补反相色谱极性选择性差的缺点,为该类化合物分离提供了新的方法和思路。