纳升级液相色谱(NanoLC-2D,Eksigent Technologies公司,美国)-电喷雾-线性离子阱质谱仪(ESI-LTQ MS,ThermoFisher Scientific公司,美国);液相色谱泵(ThermoFisher Scientific公司,美国);磁力搅拌器(海辰科瑞机电设备有限公司,北京);真空冰冻干燥机(SC100A Speedvac Plus,Thermo Savant公司,美国);高速离心机(ThermoFisher Scientific公司,美国); Milli-Q A10型纯水仪(Millipore公司,美国); 15 cm×75 μ m直喷头空管柱(New Objective公司,美国);直径3 μ m、孔径10 nm的十八烷基硅胶(ODS)填料(金欧亚公司,北京)。

牛血清白蛋白(BSA)购自北京迪拜尔生物技术有限公司;测序级胰蛋白酶购于美国Promega公司;二硫苏糖醇(DTT)、碘乙酰胺(IAA)、碳酸氢铵、甲醇、乙腈购自美国Sigma公司;乙醇、异丙醇、氯仿购自国药集团化学试剂有限公司。

平行称取6份2.5 mg粒径3 μ m的ODS填料分别加入6个1.5 mL塑料离心管中,依次编号为1、2、3、4、5和6,分别在1～6号管中加入750 μ L分析纯的甲醇、乙醇、异丙醇、乙腈、水、氯仿,涡旋30 s,使其均匀分散,静置10 min后观察填料沉降状态,以沉降速度作为匀浆溶剂选择的依据之一。

称取10 mg粒径3 μ m的ODS填料置于4 mL塑料离心管中,并在其中放入工程塑料包埋铁棒制作的磁子,剩余体积用甲醇补满后盖紧离心管盖。将离心管竖直放置在磁力搅拌器上,将磁力搅拌器打开并逐渐升到最大功率档位,在30 min内持续观察填料沉降状态,依据匀浆液的分散程度确定最佳搅拌速度。

如图1a所示,多通道匀浆装填毛细管色谱柱的装柱罐包括匀浆罐(1)、匀浆罐盖(2)、连接管(3)、固定螺母(4)和固定螺母(5)以及毛细管色谱柱空管(6)。其中匀浆罐是由不锈钢加工而成的一个正六方体,其高为39 mm,平行平面间距为54 mm。其内部为盛放色谱填料匀浆液的腔体(7)(高为18 mm,直径为12 mm,体积为2 mL)(如图1b所示);六面体的每一面都有一个阴性孔与腔体连通,其位置在距腔体底部以上10 mm;在腔体(7)中放一个磁子(8);匀浆罐盖(2)由不锈钢加工而成,其上有与固定螺母(4)连接的阴性孔,与匀浆罐(1)之间通过圆形聚四氟乙烯密封垫实现密封;连接管(3)为能够耐受40 MPa以上压力的不锈钢管或工程塑料管,其中一端与匀浆罐盖(2)连接,另一端与高压色谱泵连接,且高压色谱泵能够提供大于40 MPa的压力;固定螺母(4)和(5)配套有锥形不锈钢垫圈或锥形工程塑料垫圈以及固定毛细管和毛细管色谱柱的工程塑料套管;毛细管色谱柱空管(6)为内径小于0.3 mm,外径略小于毛细管工程塑料管内径且能耐受40 MPa压力的玻璃毛细管。按此设计加工和组装,图1c为由匀浆罐、液相色谱泵、储液罐和磁力搅拌器组装的多通道匀浆装填毛细管色谱柱装置的实物照片。

图 1

Fig. 1

图 1 多通道匀浆装填毛细管色谱柱新装置的(a)整体结构示意图、(b)剖面结构示意图和(c)装置的实物照片 Fig. 1 (a) A schematic diagram,(b) a cross-sectional diagram and (c) a photo of a multiple-channel can for packing capillary chromatographic column 1. multiple-channel can； 2. lid of multiple-channel can； 3. tube； 4. nut； 5. nut； 6. capillary chromatographic column； 7. cavity of multiple-channel can； 8. magnetic stick.

首先选取需要装填的毛细管色谱柱空管和个数,将其分别固定于匀浆罐的任意一个阴性孔上。如果装填的毛细管色谱柱少于6根,剩余的阴性孔用堵头封闭。然后选择需要装填的色谱填料,用匀浆试剂将其配制成匀浆液并转移到匀浆罐的圆柱形腔体中,放入磁子,装上匀浆罐盖后,将匀浆罐放在磁搅拌器上,调节磁子转速到适当大小对匀浆液进行搅拌。通过连接管将匀浆罐与高压色谱泵连接后,打开色谱泵电源开关,调节流动相的流速,流动相携带色谱填料进入毛细管色谱柱,等待色谱柱装填到需要的长度后,关闭高压色谱泵,使装填系统压力与大气压平衡后,卸下毛细管色谱柱,对其性能进行测试和评价。

采用上述方法分别装填了3批毛细管色谱柱,其中2批分别装填6根毛细管色谱柱(其中1批柱编号分别为0403-1、0403-2、0403-3、0403-4、0403-5、0403-6,另1批柱编号分别为0407-1、0407-2、0407-3、0407-4、0407-5、0407-6。另外一次装填1根毛细管色谱柱的编号为0410。在液相色谱-质谱联用系统上对这些毛细管色谱柱的性能进行评价,主要考察同批次装填的6根毛细管色谱柱性能的稳定性、不同批次装填的色谱柱性能的稳定性以及一次装填1根毛细管色谱柱与一批装填6根毛细管色谱柱性能的稳定性。在比较之前,选择1批装填的任1根毛细管色谱柱重复分离1个样品6次,以其在液相色谱-质谱联用系统上的性能结果作为参考来评价不同毛细管色谱柱的性能。

取100 mg BSA,以50 mmol/L 碳酸氢铵溶液溶解至终浓度为1 mg/mL,加入DTT(终浓度为10 mmol/L),在37 ℃恒温箱中放置4 h。再加入碘乙酰胺(终浓度为50 mmol/L),暗处放置1 h。按照胰蛋白酶与BSA的质量比为1 ∶ 50加入胰蛋白酶,在37 ℃下酶切18 h,用C18柱脱盐,冷冻干燥后用流动相A液复溶,并使肽段终浓度为1 μ g/ μ L。

所用带喷头的毛细管色谱柱的规格为15 cm×75 μ m,装填的全多孔型反相色谱填料的粒径为3 μ m,孔径为10 nm。在NanoLC-2D毛细管液相色谱仪上对毛细管反相色谱柱的性能进行评价。流动相A为2%(v/v)乙腈和0.1%(v/v)甲酸的水溶液,流动相B为98%(v/v)乙腈和0.1%(v/v)甲酸的水溶液;梯度洗脱程序:0～5 min,5%B～8%B; 5～30 min,8%B～40%B; 30～35 min,40%B～95%B; 35～40 min,95%B; 40～42 min,95%B～5%B; 42～52 min,5%B。流动相流速为300 nL/min。

液相色谱-质谱联用分析时,选用电喷雾离子源、正离子模式采集数据,毛细管温度设定为180 ℃,质谱扫描范围设为m/z 400.0～1 600.0,采集时间设为52 min。采用数据依赖模式(DDA)进行串联质谱分析,选取一级质谱中10个信号最强的离子进行二级质谱分析,其碰撞能量设为35% ,采用动态排除功能(dynamic exclusion),排除时间为30 s。

将质谱采集后产生的raw文件通过Thermo Proteome Discoverer软件(版本号1.3.0.339,ThermoFisher Scientific公司,美国)对质谱数据进行检索,其参数设置:母离子质量偏差(precursor tolerance)为0.5 Da;碎片离子质量偏差(fragment tolerance)为0.8 Da;假阳性率(FDR)为1% ;蛋白质酶解选用胰蛋白酶,选择2个漏切位点;固定修饰:半胱氨酸的烷基化修饰;可变修饰:甲硫氨酸氧化修饰;蛋白质数据库为牛血清白蛋白数据库(2015年2月30日从http:/ /www.ncbi.nlm.nih.gov/protein/? term=bsa下载)。

填料在溶剂中沉降的速率公式为^[5]:

为了保证毛细管柱填充均匀致密,首先应使悬浮液尽量稳定,防止在色谱柱填充过程中填料颗粒分级沉淀。从以上公式可以看出,对某一种粒径的填料可以通过两种方法来减小其沉降速度:一是选择溶剂密度与填料颗粒密度相近的溶剂;二是选择溶剂黏度系数较大的溶剂。另外,选取极性和填料相近的溶剂也能使填料较好地润湿和分散在匀浆液中。同时,还需要从实验者安全角度及溶剂成本考虑,选取毒性小、价格便宜的溶剂配制匀浆。基于此,我们选择了6种溶剂(见表1)进行试验，考察6种溶剂对3 μ m ODS填料的悬浮液涡旋混匀后放置10 min后的分散状态，由图2可见填料在氯仿中分散均匀,但是考虑到其毒性以及对装置中使用的塑料部件所具有的溶解作用,不能选择氯仿作为匀浆溶剂;水由于极性大,无法分散填料;乙醇、异丙醇对填料的分散状态稍好于甲醇、乙腈,但由于它们的黏度大,装柱时产生的压力大;而乙腈的价格较甲醇高,故选择甲醇作为匀浆溶剂装填毛细管色谱柱。

表 1 (Table 1)

表 1 6种匀浆溶剂的黏度和密度 Table 1 Viscosities and densities of six reagents used for preparing slurry Reagent Viscosity (20 ℃)/(mPa\5s) Density/(g/mL) Methanol 0.551 0.791 Ethanol 1.20 0.789 Isopropanol 2.43 0.786 Acetonitrile 0.375 0.790 Chloroform 0.563 1.48 Water 1.01 1.00

表 1 6种匀浆溶剂的黏度和密度 Table 1 Viscosities and densities of six reagents used for preparing slurry

图 2

Fig. 2

图 2 μ m ODS填料分散在不同溶剂中的分散状态 Fig. 2 Suspended states of 3 μ m ODS in different solvents Solvents: 1. methanol; 2. ethanol; 3. isopropanol; 4. acetonitrile; 5. water; 6. chloroform.

逐渐增加磁力搅拌器的功率档,在最大功率档搅拌匀浆液,持续观察30 min,匀浆液一直维持均匀分散状态,说明在磁力搅拌条件下,甲醇能够均匀分散ODS填料,可以满足毛细管色谱柱装柱时对匀浆液的要求。

以本装置1次装填了6根毛细管色谱柱,从中随机选取1根毛细管色谱柱,在液相色谱-质谱联用系统上分别对BSA酶切肽段混合物进行6次色谱分离分析,对柱效、保留时间及柱压的稳定性进行考察,并以此作为比较同一批次装填的6根色谱柱的柱效和保留时间稳定性的参考。

图3为采用同一根色谱柱重复6次色谱分离BSA酶切肽段混合物的基峰总离子流色谱图,表2为图3中的峰容量以及软件搜库后的覆盖率。另外,在总离子流色谱图中出峰时间前、中和后3个位置提取m/z 722.95、m/z 653.90、m/z 582.71 3个信号强度较强的离子色谱峰,分别比较6次色谱分离的保留时间,结果如表3所示。以相对标准偏差(RSD)表示其离散程度:峰容量的RSD=7.3% ;覆盖率的RSD=5.3% ; m/z 722.95峰保留时间的RSD=0.9% ,m/z 653.90峰保留时间的RSD=0.3% ,m/z 582.71峰保留时间的RSD=0.5% 。从表2和表3的结果可知,由于液相色谱-质谱联用分析过程中受随机因素的影响,即使采用一根毛细管色谱柱重复分离同一样品,其峰容量、蛋白覆盖率及保留时间也会有一定的波动。我们将此结果作为评价同一批次装填的6根毛细管柱稳定性的参考。

图 3

Fig. 3

图 3 同一根色谱柱重复6次分离BSA酶切肽段混合物的基峰总离子流色谱图 Fig. 3 Base peak chromatograms of the separation for six times on the capillary chromatographic column of a peptide mixture digested from BSA

表 2 (Table 2)

表 2 同一根色谱柱重复6次分离鉴定BSA酶切肽段混合物的峰容量及覆盖率比较 Table 2 Comparison of peak capacities and sequence coverages in the separation and identification for six times on the capillary chromatographic column of a peptide mixture digested from BSA Separation Peak capacity Sequence coverage/% 1 27 45.11 2 28 49.57 3 29 48.89 4 23 43.22 5 26 46.31 6 28 49.91 Average value 27 47.17 RSD/% 7.3 5.3

表 2 同一根色谱柱重复6次分离鉴定BSA酶切肽段混合物的峰容量及覆盖率比较 Table 2 Comparison of peak capacities and sequence coverages in the separation and identification for six times on the capillary chromatographic column of a peptide mixture digested from BSA

图4为0407-1、0407-2、0407-3、0407-4、0407-5和0407-6毛细管色谱柱分离BSA酶切肽段混合物的基峰总离子流色谱图;表4和表5分别列出了其峰容量、覆盖率和从总离子流色谱图中提取的m/z 722.95、m/z 653.90、m/z 582.71 3个离子的保留时间;图5为各毛细管色谱柱分离样品时的压力曲线。从表4和表5可知,峰容量的RSD=7.1% ;覆盖率的RSD=3.8% ; m/z 722.95峰保留时间的RSD=6.0% ,m/z 653.90峰保留时间的RSD=2.7% ,m/z 582.71峰保留时间的RSD=4.2% ;从图5可知,在液相色谱分离的有效梯度时间内(即5 ～30 min)0407系列毛细管色谱柱的柱压范围为(11.5±1.5) MPa。

表 3 (Table 3)

表 3 1根色谱柱重复6次分离中3个离子的保留时间的重复性 Table 3 Repeatability of retention times of three ions in the separation for six times on the capillary chromatographic column of a peptide mixture digested from BSA Ion Retention times/min Average value/min RSD/% 1 2 3 4 5 6 m/z 722.95 8.64 8.79 8.64 8.55 8.59 8.64 8.64 0.9 m/z 653.90 16.44 16.37 16.43 16.31 16.36 16.41 16.39 0.3 m/z 582.71 20.29 20.40 20.49 20.51 20.6 20.55 20.47 0.5

表 3 1根色谱柱重复6次分离中3个离子的保留时间的重复性 Table 3 Repeatability of retention times of three ions in the separation for six times on the capillary chromatographic column of a peptide mixture digested from BSA

图 4

Fig. 4

图 4 0407系列毛细管色谱柱(0407-1~0407-6)分离BSA酶切肽段混合物的基峰总离子流色谱图 Fig. 4 Base peak chromatograms of the separation of a peptide mixture digested from BSA on the capillary chromatographic columns denoted as 0407-1-0407-6

表 4 (Table 4)

表 4 0407系列毛细管色谱柱(0407-1~0407-6)分离鉴定BSA酶切物的峰容量及覆盖率比较 Table 4 Comparison of peak capacities and sequence coverages in the separation and identification of a peptide mixture digested from BSA on the capillary chromatographic columns denoted as 0407-1-0407-6 Column Peak capacity Sequence coverage/% 0407-1 26 50.43 0407-2 31 53.17 0407-3 29 48.71 0407-4 28 51.46 0407-5 28 51.11 0407-6 25 47.34 Average value 27.8 50.37 RSD/% 7.1 3.8

表 4 0407系列毛细管色谱柱(0407-1~0407-6)分离鉴定BSA酶切物的峰容量及覆盖率比较 Table 4 Comparison of peak capacities and sequence coverages in the separation and identification of a peptide mixture digested from BSA on the capillary chromatographic columns denoted as 0407-1-0407-6

相对于以1根毛细管色谱柱重复6次分离同一样品的分离结果,0407系列6根毛细管色谱柱分离样品保留时间的RSD值与前者最大差异为8倍,柱压波动范围为±12.9% ,峰容量的RSD值比前者小2.7% ,覆盖率的RSD值比前者小28.3% 。由此得出结论,同一批次装填的6根毛细管色谱柱虽然保留时间和柱压有所差异,但柱效基本一致。

以0403系列毛细管色谱柱分离BSA酶切肽段混合物,类似于2.3.2节中0407系列毛细管色谱柱 的柱效分析。通过对实验结果进行分析,0403-1～0403-6系列色谱柱的覆盖率依次为53.34% 、54.55% 、51.80% 、44.94% 、55.57% 、56.26% ,以Grubbs法判断,44.94%这个数值应舍去(置信度95% ),其他数据平均值54.30% ;峰容量依次为33、33、34、29(舍去)、35、34,平均值为33.8; m/z 722.95的保留时间依次为16.91、16.58、15.91、14.63、13.11、12.84 min,平均值15.00 min; m/z 653.90的保留时间依次为21.51、22.57、23.63、19.67、18.79、20.24 min,平均值21.07 min; m/z 582.71的保留时间依次为25.72、26.67、28.22、23.60、23.10、25.55 min,平均值25.48 min;在液相色谱分离的有效梯度时间内(即5～30 min),0403系列毛细管色谱柱的柱压范围为(19.2±1.9) MPa。表6和表7分别列出了0403系列毛细管色谱柱和0407系列毛细管色谱柱峰容量、蛋白覆盖率和保留时间的对比结果。

表 5 (Table 5)

表 5 0407系列毛细管色谱柱(0407-1~0407-6)分离BSA酶切物的3个离子保留时间的比较 Table 5 Comparison of retention times of three ions in the separation of a peptide mixture digested from BSA on the capillary chromatographic columns denoted as 0407-1-0407-6 Ion Retention times/min Average retention time/min RSD/% 0407-1 0407-2 0407-3 0407-4 0407-5 0407-6 m/z 722.95 11.03 12.06 11.56 11.10 12.47 12.97 11.87 6.0 m/z 653.90 17.40 18.53 17.73 16.98 17.72 17.70 17.68 2.7 m/z 582.71 22.58 23.52 21.41 20.81 21.37 21.46 21.86 4.2

表 5 0407系列毛细管色谱柱(0407-1~0407-6)分离BSA酶切物的3个离子保留时间的比较 Table 5 Comparison of retention times of three ions in the separation of a peptide mixture digested from BSA on the capillary chromatographic columns denoted as 0407-1-0407-6

图 5

Fig. 5

图 5 0407系列毛细管色谱柱(0407-1~0407-6)分离BSA酶切肽段混合物的柱压曲线图 Fig. 5 Column pressure diagrams of the separation of a peptide mixture digested from BSA on the capillary chromatographic columns denoted as 0407-1-0407-6

表 6 (Table 6)

表 6 0407和0403两批次装填的色谱柱分离鉴定 BSA酶切物的峰容量及覆盖率比较 Table 6 Comparison of peak capacities and sequence coverages of the separation and identification of a peptide mixture digested from BSA on the capillary chromatographic columns packed by two batches denoted as 0407 and 0403 Parameter Column batches RSD/% 0407 0403 Peak capacity 28 33.8 13.3 Sequence coverage/% 50.37 54.30 5.3

表 6 0407和0403两批次装填的色谱柱分离鉴定 BSA酶切物的峰容量及覆盖率比较 Table 6 Comparison of peak capacities and sequence coverages of the separation and identification of a peptide mixture digested from BSA on the capillary chromatographic columns packed by two batches denoted as 0407 and 0403

表 7 (Table 7)

表 7 0407和0403两批次装填的色谱柱分离BSA酶切物的3个离子的保留时间比较 Table 7 Comparison of retention times of three ions in the separation of a peptide mixture digested from BSA on the capillary chromatographic columns packed by the two batches denoted as 0407 and 0403 Ion Retention times/min RSD/% 0407 0403 m/z 722.95 11.87 15.00 16.5 m/z 653.90 17.68 21.07 12.4 m/z 582.71 21.86 25.48 10.9

表 7 0407和0403两批次装填的色谱柱分离BSA酶切物的3个离子的保留时间比较 Table 7 Comparison of retention times of three ions in the separation of a peptide mixture digested from BSA on the capillary chromatographic columns packed by the two batches denoted as 0407 and 0403

从以上结果看出,0403系列毛细管色谱柱和0407系列毛细管色谱柱之间的稳定性与0407系列6根毛细管色谱柱之间的稳定性比较,前者保留时间的RSD值比后者最大相差3.6倍,峰容量的RSD值比后者大87.3% ,覆盖率的RSD值比后者大39.5% ,两批次装填的毛细管色谱柱的柱压相差49.8% ,其波动范围是同一批次毛细管色谱柱之间的柱压波动的3.9倍。即两批毛细管色谱柱的保留时间和柱压存在较大差异,且二者的峰容量和覆盖率差异都明显大于同一批次装填的毛细管色谱柱之间的差异。由此得出结论,不同批次装填的毛细管色谱柱的性能的一致性要差于同一批次色谱柱柱效的一致性。产生这种现象的主要原因是:在开始装填毛细管色谱柱时,随着溶剂携带填料进入毛细管柱并在喷头处形成筛板,由于各个商品化的空毛细管柱喷头内径不完全一致,筛板的形成方式各不相同,造成毛细管色谱柱柱压不同,进一步造成填料在毛细管柱中的堆积方式不同;另外,在毛细管色谱柱装填过程中,随着毛细管色谱柱装填长度的增加,为使压力不至于超过液相色谱泵能提供的最大压力,需要通过调节溶剂流速来控制压力,但由于不同批次装填的毛细管柱的筛板形成情况、压力变化不会完全一样,流速调节过程也不同,这样就导致了不同批次装填的毛细管色谱柱的填料逐渐堆积方式有所不同,导致其色谱性能的一致性要差于同一批次色谱柱柱效的一致性。

0410毛细管色谱柱分离BSA酶切肽段混合物的峰容量为30，覆盖率为53.08% ,3个特定离子(m/z 722.95、653.90、582.71)的保留时间分别为12.88、18.08、21.72 min,柱压为16.1 MPa。

将0410毛细管色谱柱与0407系列毛细管色谱柱的性能进行比较,二者之间峰容量的RSD=4.9% ,覆盖率的RSD=3.8% ,3个离子保留时间的RSD分别为5.8% 、1.6%和0.5% ,其值小于两批次装填的毛细管色谱柱峰容量、覆盖率及保留时间的RSD。再将0410毛细管色谱柱与 0403系列毛细管色谱柱的性能进行比较,二者之间峰容量的RSD=8.5% ,覆盖率的RSD=1.7% ,3个离子保留时间的RSD分别为10.8% 、10.9%和11.3% ,其值不大于两批次装填的毛细管色谱柱峰容量、覆盖率及保留时间的RSD。0410毛细管色谱柱与0407系列毛细管色谱柱的柱压相差33.2% ,二者柱压之间的差别小于两批次装填毛细管色谱柱之间柱压的差别。即以我们设计的多通道匀浆装填毛细管色谱柱的新装置一次装填1根与一次装填6根毛细管色谱柱的性能没有明显的区别。以上结果表明,批量装填毛细管色谱柱比一次仅装填1根毛细管色谱柱具有优势。

本文发展了一种多通道匀浆装填毛细管色谱柱的新装置,采用该装置可显著提高毛细管色谱柱的装填效率。通过对该装置使用条件的优化,采用牛血清白蛋白的胰蛋白酶酶切肽段混合物为样本,以峰容量、蛋白覆盖率、保留时间和柱压为指标,对本装置同时以及不同批次装填的毛细管色谱柱的性能进行评价和比较,实验结果表明同一批次装填的毛细管色谱柱的性能相近;不同批次装填的毛细管色谱柱以及一次装填1根和一次装填6根毛细管色谱柱的峰容量和覆盖率没有明显的区别,但保留时间和柱压相差较大。这些结果将为实际应用中毛细管色谱柱的选择和使用提供参考。