食品中PAEs的样品前处理通常包括提取和净化两个步骤,目的在于尽可能完全地从食品基质中提取目标物,并去除干扰仪器检测的蛋白质、脂肪、色素等。

液液萃取是塑化剂检测中应用最为广泛的提取技术,PAEs是高脂溶性化合物,所以提取溶剂通常为正己烷、乙酸乙酯、二氯甲烷、乙醚、丙酮等非极性溶剂或不同比例的混合溶剂。根据食品基体组成差异,如固态或液态、油性或水性、蛋白及脂肪含量等性质,选择样品分散溶剂、提取溶剂及其比例,以最大限度地提取样品中的PAEs。对于水或果汁饮料等水性基质样品,仅需采用正己烷提取即可获得满意的回收率^[5]。蜂蜜样品经过水溶后,采用正己烷提取,蜂王浆采用正己烷和丙酮(1 ∶ 1,v/v)提取,回收率可达80.1% ～110.9%^[6]。对于酒类样品,因为乙醇的存在改变了塑化剂在非极性提取溶剂和水相的分配系数,直接萃取效率低,实验表明,先去除酒类样品中大部分的乙醇后,用正己烷提取的效率可从20% ～75%提高至80.8% ～128.6%^[7]。祝伟霞等^[8]采用乙腈溶剂分散植物油、起酥油、辣椒酱、豆瓣酱、饼干等多种含油食品,加水稀释后,再用正己烷萃取其中的18种PAEs,除邻苯二甲酸二异癸酯(DIDP)的平均回收率为53.4%外,其他17种PAEs的回收率在76.8% ～107.9%之间。液液微萃取技术是一种集采样、萃取和浓缩于一体的样品前处理方法^[9]。Leng等^[10]采用涡旋辅助表面增强乳化液相微萃取,以表面活性剂Triton X-100辅助四氯化碳萃取白酒中的PAEs,回收率为77.8% ～93.7% ,整个前处理仅需30 s。Cinelli等^[11]以二氯甲烷为萃取剂,采用超声辅助分散液液微萃取结合气相色谱-离子阱质谱(gas chromatography-ion trap mass spectrometry,GC-IT/MS)测定红酒中的PAEs,回收率为85% ～100.5% ,富集倍数达到220～300倍,检出限为0.022 g/L。

对于水、酒等相对简单的样品,溶剂提取后可直接上样或浓缩后检测,但是对于复杂的食品样品,食品中的脂肪及色素可被提取剂同时萃取,会严重干扰仪器检测,需要进行净化处理以减小或消除基质干扰,并实现浓缩。除了传统的固相萃取(SPE)、固相微萃取(SPME)和凝胶渗透色谱(GPC)等净化技术之外,一些新型的样品前处理技术也有应用与尝试。

SPE是目前PAEs净化常见的一种方式,根据分析样品基质差异,N-丙基乙二胺键合硅胶玻璃柱(ProElut PSA)^{[12, 13]}、混合型阴离子交换(MAX)^[14]、中性氧化铝柱^[15]、硅胶柱^[16]、C18^{[17, 18]}等固相萃取吸附剂均有应用。李拥军等^[16]采用硅胶柱净化分析罗非鱼样品中PAEs,净化效果较好,基质干扰小,回收率为75% ～107.9% 。当采用单一类型固相萃取柱净化效果不理想时,可采用混合填料、多级净化等模式改善。Wu等^[19]采用SILICA/PSA玻璃固相萃取柱有效去除了食用油中油脂、色素、有机酸和酚类化合物等干扰,检测了食用油中的17种PAEs,回收率为78.3%~108.9% 。张帆等^[17]比较了单壁碳纳米管玻璃固相萃取小柱(SWCNTs)、PSA玻璃固相萃取小柱和C18玻璃固相萃取小柱对PAEs的净化效果,SWCNTs SPE对选取的6种PAEs的回收率范围为86.7% ～114.6% ,PSA SPE为77.9% ～120.1% ,C18 SPE为74.5% ～104.8% 。比较发现单壁碳纳米管固相萃取净化油样品,净化效果不亚于商业吸附剂。

SPME是集采样、萃取、浓缩和进样于一体的无溶剂样品微萃取技术,在食品中PAEs化合物的分析中得到较广泛应用。Carrillo等^[20]比较了顶空固相微萃取(HS-SPME)的聚乙二醇-二乙烯基苯(CW-DVB)、聚丙烯酸酯(PA)和聚二甲氧基硅烷-二乙烯基苯(PDMS-DVB)3种纤维萃取头的萃取效果,发现CW-DVB和PDMS-DVB均可有效提取红酒中的PAEs,检出限为35 ng/L。Li等^[21]采用多壁碳纳米管-硅涂层实现了对饮料和酒中塑化剂的快速分析,回收率为68% ～115% 。Ye等^[22]采用杯芳烃涂层的SPME实现了啤酒中PAEs的富集,8种PAEs的检出限为0.003～3.429 g/L。

GPC技术已广泛用于去除油脂样品中的脂质和色素等干扰物,油样直接用流动相稀释后经GPC净化、浓缩后检测^[23],二氯甲烷-环己烷、乙酸乙酯-环己烷是常用的流动相,但是在PAEs类化合物检测中最主要的问题是控制调整馏分切割起止时间,其会影响油脂、色素等成分的去除及目标化合物的收集效果,所以必须根据实际样品选择最佳的截取时间^[24]。

为简化操作流程、节约溶剂、提高通量,基质固相分散(MSPD)、分散固相萃取(DSPE)、QuEChERS等前处理技术在PAEs分析中也有报道。杨悠悠等^[5]采用无水MgSO₄和PSA基质分散净化牛奶样品,可显著降低基质的干扰、提高结果准确度,方法回收率为60% ～110% 。王明林等^[25]采用弗罗里硅土-石墨化炭黑为基质分散剂和净化剂、乙酸乙酯为淋洗剂的基质固相分散样品前处理方法,较好地提取了蔬菜样品中的5种PAEs,回收率为76% ～90% ,检出限为0.01～0.024 mg/kg。邓莉等^[26]采用PSA材料分散固相萃取(DSPE),有效消除了油、罐头食品共萃取物中脂肪酸、有机酸、极性色素及糖类等的干扰,回收率为78% ～113% ,检出限为0.03～0.5 mg/L。孙欣等^[27]采用QuEChERS技术实现了黄瓜中PAE的提取净化,回收率为63.3% ～127.8% ,检出限为0.2～3.5 μ g/kg。

PAEs是弱极性化合物,其沸点在180～500 ℃,适合GC分离分析。GC具有效率高、分离效果好、分离能力强等特点,是PAEs定性、定量首选的检测手段,应用最为广泛。

分离PAEs最常用的是DB-5类型的毛细管色谱柱,大多数PAEs能够较好地分离,满足分析要求,但是对于碳原子数较多的异构体化合物(如DINP和DIDP)分离效果差,峰形重叠,呈五指峰形,检出限高,影响准确的定性和定量^[15]。王美飞等^[28]发现采用不同上样溶剂,PAEs在GC-FID上的响应有显著差异,甲醇作溶剂时,目标化合物的响应值偏小、峰形不对称、进样重复性差,对定量结果影响较大;而采用弱极性和非极性溶剂,如正己烷、乙酸乙酯、丙酮、二氯甲烷等,能够提高样品测定的精密度和准确度。因为FID检测中主要靠色谱保留时间定性,对于复杂食品基体,可能存在杂质干扰、分离度不理想等问题而导致假阳性结果,因此近年来质谱检测器的应用越来越普遍。2008年,我国颁布食品中16种PAEs残留检测的国家标准(GB/T 21911-2008),GC-MS选择离子扫描(SIM)检测,不含油脂样品采用正己烷提取,检出限为0.05 mg/kg;含油脂样品采用GPC净化,检出限为1.5 mg/kg^[29]。

因为部分PAEs化合物的离子峰相同,且存在较严重的基质干扰,定性对色谱分离的要求依然较高,而二级质谱则能够进一步提高定性、定量的准确度与灵敏度。Cavaliere等^[30]比较了GPC净化橄榄油样品几种分析方法的检测结果,EI-GC-MS检测DMP的LOD为68 μ g/kg,EI-GC-MS/MS则为0.1 μ g/kg,可见MS/MS检测的灵敏度显著提高;同时比较了EI源和化学电离(CI)源对PAEs响应的差异,EI源的定量重复性为3.0% ～9.7% ,而CI源为3.2% ～64.4% ,表明EI源稳定性更佳。

Ye等^[22]建立了SPME-GC联用方法检测啤酒中的PAEs,回收率为86.3% ～109.3% ,检出限可达0.003～3.429 μ g/L,操作简单,溶剂用量少。

GC-MS分析中,外标法因为受目标物提取与净化过程损失、分离与检测条件(柱温、柱效、检测器响应、基质效应)等影响较大,在多组分PAEs分析中应用较少,内标法的应用更加普遍。Guo等^[14]以己二酸二丁酯作内标分析了火腿肉中的PAEs,方法回收率为87.3% ～108% ,重复性为3.6% ～8.2% 。为了进一步提高方法的准确度,Carrillo等^[31]首次采用HS-SPME GC-MS同位素内标法测定酒中的6种PAEs,回收率介于72% ～121%之间,大部分都在100%左右,相比非同位素定量方法的回收率64% ～135%^[20],有了显著的改善。Ierapetritis等^[15]采用SPE净化样品,建立了植物油中PAE的同位素内标定量方法,LOD达7～10 ng/g。我们^[7]采用对应的16种同位素标记物,建立了白酒中16种PAEs的同位素稀释气相色谱-三重四极杆串联质谱( isotope-dilution coupled with gas chromatography-tandem mass spectrometry,GC-IDMS/MS)的MRM模式定量方法。外标校准曲线法测定16种PAEs的回收率为80.8% ～128.6% ,相对标准偏差为1.1% ～12.9% 。同位素内标法回收率范围为94.3% ～105.3% ,相对标准偏差低于6.5% ,同位素内标法提高了定量结果的准确性。同时,对于色谱分离度不佳的邻苯二甲酸丁基苄基酯(BBP)和邻苯二甲酸二己酯(DHXP)两个化合物,文献检测均采用m/z 149/65离子对定量,我们选择m/z 206/149检测BBP,m/z 251/149检测DHXP,可实现两者基线分离,检出限为0.1～10.0 ng/g。因此,同样的实验条件下,同位素内标定量方法可以校正前处理过程的损失,在基体的痕量成分测定中较外标法的灵敏度更高,特异性更强,精密度更好。若实验条件许可,同位素内标法更适合复杂基体痕量成分的准确定量分析。

表2给出了食品中PAEs测定的样品前处理方法及分析方法。

表 2 (Table 2)

表 2 用于食品中邻苯二甲酸酯类化合物分析的前处理方法及分析方法 Table 2 Pretreatment methods and analytical methods for phthalate esters in food Ref. Sample matrix Number of PAEs Pretreatment method Analytical method Recovery & LOD Advantages of the method [5] beverage wine and milk 16 liquid-liquid extraction and dispersive solid-phase extraction (d-SPE) GC-MS,EI,SIM mode,external standard method 60% -110%0.005-0.025 mg/L easy pretreatment method and environmental friendly [6] honey and royal jerry 22 honey dissolved in water and extracted by hexane,royal jerry extracted by hexane and acetone (1 ∶ 1,v/v) GC-MS,EI,SIM mode,external standard method 80.1% -110.9%0.3-3.0ng/g simple pretreatment method for high sugar matrix [7] Chinese spirits 16 ethanol removed by heating with a water bath at 100 ℃ and then was extracted with n-hexane twice GC-MS/MS,EI,MRM mode,isotope dilution internal standard method 94.3% -105.3%0.1-10ng/g easy pretreatment methods and good accuracy of the results by using IDMS method [8] oily stuffs 18 oil sample extracted with acetonitrile,or after mixed with water; n-hexane as the solvent of liquid-liquid extraction HPLC-MS/MS,APCI+,MRM mode,matrix matched external standard method 53.4% -107.9%0.05-0.5 mg/kg APCI-MRM mode reduced interference [10] liquors 4 vortex-assisted surfactant-enhanced-emulsification liquid-liquid micro-extraction (LLME) GC-MS,EI,SIM mode,external standard method 77.8% -93.7%4.9-13 ng/L quick extraction pretreatment,extraction equilibrium within 30 s [11] wines 6 ultrasound-vortex-assisted dispersive liquid-liquid micro-extraction(DLLME) GC-IT/MS,EI,SIM mode,external standard method 85% -100.5%0.075-0.022 μ g/L high enrichment factor of the six analytes ranges from 220- to 300-fold [12] fatty foods 20 extracted with acetonitril,and cleaned up by ProElut GLASS PSA SPE UHPLC-MS/MS,ESI+,MRM mode,external standard method 80.9% -121.5%0.02-1.6 μ g/kg fast method by using UHPLC [13] dairy foods 23 extracted with hexane or acetonitrile,and cleaned up with a glass ProElut PSA SPE GC-MS,EI,SIM mode,external standard method 77% -112%0.005-0.05 mg/kg pretreatment method is applicable to different food matrix [14] hamsausages 6 homogenized with hexane and cleaned up with Oasis MAX SPE GC-MS,EI,SIM mode,internal standard method 87.3% -108%0.29-0.61ng/g internal standard method makes the results more reliable [15] vegetable oils 11 extraction by acetonitrile with precipitation under freezing and subsequent SPE using alumina GC-MSn,EI,SIM mode,isotope dilution internal standard method 7-600ng/g isotope dilution internal standard method improved the accuracy of the results [16] tilapia 9 extracted with ethyl acetate and purified with LC-Si SPE HPLC-MS/MS,ESI+,MRM mode,matrix matched external standard method 75% -107%＜0.5 μ g/kg sensitive and accurate method [17] camellia oils 6 diluted by hexane and then cleaned up with a glass SWCNTs SPE GC-MS,EI,SIM mode,external standard method 86.4% -111.7%0.01-0.03 mg/kg SPE based on SWCNTs as absorbent results in good accuracy and high recovery [18] red wines 6 extracted with SPE method on C18 column GC-MS,EI,SIM mode,external standard method 33% -109%0.015-0.018 μ g/mL applicable to PAEs screening in wines at sub ppm level [19] edible vegetable oils 17 extracted with acetonitrile and cleaned up with silica/PSA-mixed SPE column GC-MS,EI,SIM mode,external standard method 78.3%-108.9%0.05-0.15 mg/L interfering of the matrices was effectively removed by mixed SPE [20] red wines 6 head-space solid-phase micro-extraction (HS-SPME) GC-MS,EI,SIM mode,external standard method 64% -135%0.04-2.9 μ g/L automatic pretreatment method [21] beverage and alcoholic samples 3 SPME based on multi-walled carbon nanotubes (MWCNTs)/silica reinforced hollow fiber GC-MS,EI,SIM mode,external standard method 68% -115%0.006-0.03 μ g/L new SPME absorbent material increase the adsorption capability towards PAEs [22] beers 8 SPME GC-FID,external standard method 86.3% -109.3%0.003-3.429 μ g/L automatic pretreatment method and environmental friendly [23] edible oils,instant noodles,fried pastries,saqimaetc. 5 extracted with petroleum ether in an ultrasonator,and purified by a gel permeation chromatography (GPC) HPLC-DAD,external standard method 70.4% -113.6%3.25-13.4 μ g/L easy pretreatment method and applicable to fat-contained matrix [24] chili sauces 14 extracted with petroleum ether in an ultrasonic field,followed by clean-up by GPC HPLC-DAD,external standard method 85.7% -100.8%0.25-2.0 mg/kg sensitive and applicable to be used to analysis 14 PAEs in chili sauce [25] vegetables 5 matrix solid-phase dispersion(MSPD): Florisil as solid dispersion sorbent,graphitized carbon black as purificant GC-MS,EI,SIM mode,external standard method 76% -90%0.01-0.024 mg/kg quick and easy pretreatment method [26] fat-containing foods 15 dispersive solid phase extraction (DSPE),PSA as the sorbent GC-MS,EI,SIM mode,external standard method 78% -113%0.03-0.5 mg/L quick and easy pretreatment method [27] cucumbers 19 QuEChERS GC-MS/MS,EI,MRM mode,external standard method 63.3% -127.8%0.2-3.5 μ g/kg easy and quick method [29] foods 16 hexane extraction and GPC clean up GC-MS,EI,SIM mode,external standard method 0.05-1.5 mg/kg applicable to different food matrix [30] olive oils 6 GPC clean-up GC-MS/MS,EI,MRM mode,isotope dilution internal standard method 71.7% -112.2%0.1 μ g/kg electron and isobutane-chemical ionization,were compared. In MS/MS mode,EI achieved better analytical performances [31] wines 6 HS-SPME GC-MS,EI,SIM mode,isotope dilution internal standard method 72% -121%35 ng/L isotope dilution internal standard method improved the accuracy of the results [32] oils 6 cleaned up with PA6 nano fiber membrane SPE HPLC-UV,external standard method 85.9% -101.0%0.020-0.150 ng/mL 2.5 mg PA6 nano fiber membrane is enough for trace PAEs purification [33] dairy foods 23 liquid sample extracted by acetonitrile,while solid samples prepared by QuEChERS or glass-based SPE methods HPLC-MS/MS,ESI+,MRM mode,external standard method 75.5% -115.2%0.8-15 μ g/kg symmetrically sharp graph for DINP or DIDP was obtained and performed precise quantitative measurements [34] vegetable oils 6 extracted with acetonitrile saturated with hexane and cleaned up by d-SPE with PSA and nano carb as the sorbents HPLC-HRMS,ESI+,MRM mode,isotope dilution internal standard method 77.9% -115.6%2-4 μ g/kg isotope dilution internal standard method improved the accuracy of the results IDMS: isotope dilution mass spectrometry; APCI: atmospheric pressure chemical ionization; IT: ion trap; UHPLC: ultra high performance liquid chromatography; SWCNTs: single-wall carbon nanotubes; DAD: diode array detector; HRMS: high resolution mass spectrometry.

表 2 用于食品中邻苯二甲酸酯类化合物分析的前处理方法及分析方法 Table 2 Pretreatment methods and analytical methods for phthalate esters in food

与气相色谱法相比,液相色谱法在PAEs的同分异构体的分离及定量分析中更具有优势,通过选择合适的HPLC流动相组成及梯度洗脱条件,可以实现气相色谱分离中五指峰DINP和DIDP形成单峰分离检测,同时可以有效提高质谱的离子化效率,分析速度快,灵敏度高,适合于复杂基体中PAEs的准确定量。

曹阳等^[32]考察了HPLC二极管阵列检测器(DAD)检测PAEs的3个特征吸收峰(198、224、272 nm),发现198 nm处吸收强度最大但杂质干扰较多,综合考虑选择224 nm波长进行测定。Fan等^[12]采用SPE-UHPLC-MS/MS测定油脂食品中的20种PAEs,7 min内测定了油脂食品中的20种PAEs,检出限可达0.02 μ g/kg。且在ESI⁺模式下,通过选用不同的[M+H]⁺母离子产生的定量离子对,克服了GC-MS检测异构体PAEs时均采用m/z 149或m/z 149/65的定量离子的缺点,实现了一些不同的烷基取代难分离异构体的检测。

李拥军等^[16]建立了SPE-LC-MS/MS测定水产品中PAEs的方法,通过比较乙腈、甲醇有机相及添加甲酸、乙酸铵的水相的不同流动相组合,选择0.1%的甲酸水溶液(含5 mmol/L 乙酸铵)-甲醇溶液作为流动相,采用梯度洗脱,9种PAEs在13 min内达到理想的分离效果。由于水产品基质复杂,采用MRM特征离子对进行定性和定量,大大减少了干扰,提高了检测灵敏度,同时选用基质匹配的校准溶液进行定量分析,保证了准确性。

祝伟霞等^[8]采用LC-APCI-MS/MS测定食品中的PAEs,发现ESI离子化效率与灵敏度均高于APCI,但ESI基质抑制现象明显,与标准溶液响应强度相比,信号响应减少至约1/5,而APCI基质抑制效应小。同时,与GC-MS分析DINP和DIDP灵敏度低(得到一组五指峰群)相比,LC-APCI-MS/MS测定DINP和DIDP时,均能获得峰形对称的单峰,提高了检测灵敏度。Xu等^[33]采用C18色谱柱、甲醇-0.1%甲酸水为流动相的LC-ESI-MS/MS方法,也实现了DINP和DIDP的对称尖峰分离,同时实现了对这两类同分异构体的准确定量,检出限小于15 μ g/kg。

陈达炜等^[34]采用高效液相色谱-四极杆/静电场轨道阱高分辨质谱建立了PSA与Nano Carb混合填料的分散固相萃取快速分析植物油中16种PAEs的检测方法,并比较了UPLC BEH C18和UPLC BEH Phenyl两种色谱柱对于邻苯二甲酸酯的分析效果。由于邻苯二甲酸酯结构中有苯环,Phenyl柱比C18柱具有更好的保留行为,更为适合邻苯二甲酸酯的分析。该研究采用高分辨质谱的精确相对分子质量进行定性,同位素稀释质谱法定量,16种PAEs的平均回收率为77.9% ～115.6% ,相对标准偏差为0.3% ～8.9% 。

王晓兵等^[35]采用LTQ-Orbitrap高分辨质谱仪结合全自动筛选软件,通过精确相对分子质量、离子阱多级碎片的结构信息、保留时间,建立了PAEs的筛查和确证方法,有效地去除了基体干扰,并在一定程度上降低了对色谱分离的要求。高分辨质谱能够在缺乏标准品或标准物质的情况下,最大限度地提高鉴别能力,有效提高未知物的鉴别效率。

由于PAEs广泛存在于塑料和有机溶剂中,而液相色谱系统中某些组成部分使用的是塑料管路,这些管路会溶出PAEs。采用液相色谱分析PAEs,背景PAEs污染的控制对降低假阳性、提高方法准确度至为重要。张海婧等^[36]在液相色谱仪的溶剂混合器和进样器中间安装捕集柱,用于富集流动相中的PAEs,延迟其出峰时间,从而与样品中的目标峰区分。同时将样品瓶盖塑料部分换成锡箔纸封口,液相系统接触流动相的塑料管路更换为PEEK材料,可有效降低体系的环境干扰。

毛细管电泳(CE)是电泳技术与色谱技术的结合,它具有高柱效、高选择性、分析速度快、进样量少等优点。李海燕等^[37]建立了CE测定水中的5种不同PAEs的方法,水样过滤后可直接进行分析,回收率在104.8% ～108.9%之间。

Zhang等^{[38, 39]}以辣根过氧化物酶为标记物,建立了直接竞争酶联免疫分析测定PAEs的方法,水及液态食品检测的最优LOD为0.03 ng/mL,回收率为96.6% ～112.4% ,交叉反应小于10% 。同时,他们^[40]还以4-氨基邻苯二甲酸二甲酯(DMAP)半抗原重氮化反应结合BSA制备多克隆抗体,建立了间接竞争酶联免疫分析法,快速测定饮料、奶、茶等食品中的邻苯二甲酸二乙酯(DEP),检出限为 0.004 9 ng/mL,与类似物的交叉反应小于9% 。另外，通过PAEs单克隆抗体的制备，可提高PAEs快筛检测的准确性，减少假阳性，这是未来PAEs免疫方法研究的热点方向。

彭丽英等^[41]以丙酮作为掺杂剂,建立了白酒中痕量PAEs快速筛查的离子迁移谱方法(IMS),并采用离子阱质谱对检测结果进行了验证,单个样品的分析周期小于95 s,适于大量白酒样品中PAEs的快速筛查。

随着人们对环境、原料与工艺、水等残留PAEs迁移进入食品中的认识及安全评估的持续开展,对检测效率和准确度的要求也越来越高。目前，串联质谱、高分辨质谱等应用越来越广泛,明显提高了检测灵敏度、降低了基质干扰,也在一定程度上降低了对样品前处理和分离的要求,但因为塑化剂通常为多组分同时检测,化合物种类多,同时又存在异构体等性质非常接近的化合物,因此高效的提取与前处理技术的发展必不可少;针对不同食品基体和化合物的特性,多种溶剂提取、新型高特异性的净化材料及混合材料的开发应用,提高复杂基体中化合物的提取、净化和富集效率是最主要的发展方向之一;适合于现场检测的试剂盒和试纸条、便携式快速检测仪器技术等,作为色谱、质谱等方法的补充,具有广阔的现实需求。另外，食用油、奶粉等复杂食品基质中多组分痕量PAEs有证标准物质的研制,满足方法准确度验证需求,对于促进检测新技术开发具有重要的基础作用。