蛋白质组学中的固定化酶反应器制备的研究进展


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张凌怡¹, 王兵兵¹, 上官露露¹, 张润生², 陈建虎¹, 张维冰¹

1. 上海市功能性材料化学重点实验室, 华东理工大学, 上海 200237;
2. 上海市现场物证重点实验室, 上海市刑事科学技术研究院, 上海市公安局, 上海 200083

收稿日期：2015-06-17

基金项目：国家重大科学仪器设备开发专项(2012YQ120044);上海市刑事科学技术研究院开放课题.

通讯作者：张维冰, E⁃mail:weibingzhang@ecust.edu.cn.

摘要：固定化酶反应器作为蛋白质组学研究中"bottom-up"策略重要的组件,具有酶解快速、酶解效率高、酶稳定性和活性高、简单易操作、能够与多种检测方式联用等优点,对于发展高效快速的蛋白质组学分析方法具有重要意义。本文就固定化酶反应器的制备方法及其在蛋白质组学中的应用做简单的概述,着重介绍酶的固定方法、固定化酶的载体、用于固定的酶的种类。近几年固定化酶反应器的研究集中于提高固酶量、保持酶活性、增加酶解效率、减小非特异性吸附等方面。研究结果表明,采用纳米材料、整体材料等新型载体,提高载体亲水性,采用多酶同时酶解等方法能够有效改善固定化酶反应器的性能,提高蛋白质的鉴定效率。

关键词：固定化酶反应器酶载体材料蛋白质组学制备

Development of preparation of immobilized enzyme reactors in proteomics

ZHANG Lingyi¹, WANG Bingbing¹, SHANGGUAN Lulu¹, ZHANG Runsheng², CHEN Jianhu¹, ZHANG Weibing¹

1. Shanghai Key Laboratory of Functional Materials Chemistry, East China University of Science and Technology, Shanghai 200237, China;
2. Shanghai Key Laboratory of Crime Scene Evidence, Shanghai Research Institute of Criminal Science and Technology, Shanghai Public Security Bureau, Shanghai 200083, China

Received: 2015-06-17

Abstract: As an important part in "bottom-up" strategy of proteomics, immobilized enzyme reactors have great significance in the development of fast and more efficient protein analytical method, owing to its advantages of high speed and enzymatic efficiency, good stability and activity, easy operation, and the possibility of hyphenating with multiple detection instruments. In this paper, the preparation methods of immobilized enzyme reactors and their applications in proteomic investigation are introduced, focusing on the nature of enzymes, the immobilization methods and the carrier materials used for immobilizing enzyme. In recent years, the investigations are focused on increasing the immobilization amounts of enzyme, keeping enzymatic activity, improving enzymatic efficiency and decreasing nonspecific adsorption. The investigation results showed that by using novel carriers such as nanomaterial and monolith, increasing of hydrophilicity of carrier and tandem hydrolysis with multiple enzymes can greatly improve the performance of immobilized enzyme reactors and increase protein identification efficiencies.

Key words: immobilized enzyme reactors enzyme carrier material proteomics preparation

蛋白质组学研究中采用的蛋白质鉴定策略^[1]主要包括“top-down”策略、“middle-down”策略和“bottom-up”策略。在“middle-down”策略、“bottom-up”策略中,蛋白质酶解成肽段再进行分析,能够获得更小的分析物相对分子质量,带电量较低,有利于提高质谱检测的灵敏度^[2],与蛋白质直接分析相比具有更大的优势,因此蛋白质的酶解受到越来越多研究团队的关注。传统的酶切方式是在溶液中酶解,此酶切方式存在步骤繁琐、酶解时间长且蛋白酶在溶液中易发生自降解导致酶解效率低的缺点。固定化酶反应器能够克服以上缺点，有效提高酶解效率。

1 固定化酶反应器简介

固定化酶反应器的概念最早在20世纪70年代提出,是将酶固定在一定的载体上,然后对蛋白质进行酶解。由于酶固定后,具有酶与底物的比例高、酶解后无需分离酶和产物、能够显著减少酶之间的接触、防止其自降解等优点,使得其与传统的自由溶液酶解相比,具有酶解快速、酶解效率高、显著提高酶稳定性、简单易操作、选择合适的载体能够与多种检测方式联用等优点^{[3, 4, 5]}。决定酶固定成功与否及其酶解性能的因素主要包括酶的种类的选择、酶的固定方法、载体的选择。

1.1 酶的种类

蛋白质酶解是蛋白质组学中最常见的裂解方法,目前较为常见的酶有胰蛋白酶、内肽酶(金属内切蛋白酶Lys-N，胞内蛋白酶Lys-C，蛋白内切酶Glu-C)、木瓜蛋白酶、胃蛋白酶、糜蛋白酶等。胰蛋白酶由于专一性强,酶切后得到的肽段的相对分子质量刚好在电喷雾(ESI)质谱检测范围之内(500～3 000 Da),而且只水解精氨酸、赖氨酸的羧基参与形成的肽键,因此是蛋白质鉴定中应用最多的蛋白质水解酶。除了胰蛋白酶之外,糜蛋白酶也是较为常用的水解酶,糜蛋白酶的水解酶切位点有苯基丙氨酸、色氨酸、酪氨酸、亮氨酸残基。胃蛋白酶^[6]作为唯一在酸性条件下使用的水解酶,它倾向于剪切氨基端或羧基端为芳香族氨基酸(如苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸)或亮氨酸的肽键。此外,Glu-C、Lys-N、Lys C等特异性酶也常应用于蛋白质组学研究,尤其是磷酸化蛋白质组学。实验表明,只固定一种酶(通常是胰蛋白酶)时酶解效率较低,尤其对于缺少赖氨酸和精氨酸残基的蛋白质(如疏水性膜蛋白)。Bian等^[7]将Glu-C与胰蛋白酶串联使用对HeLa细胞进行自由溶液酶解,显著地提高了其中磷酸化蛋白氨基酸序列覆盖度。糜蛋白酶切位点与胰蛋白酶互补,且其适宜的pH与胰蛋白酶接近,常被应用于多酶共同酶解以提高酶解效率。Shangguan等^[8]将糜蛋白酶和胰蛋白酶同时固定到掺杂介孔氧化硅材料SBA-15的有机-无机杂化整体柱上,获得的双酶反应器比单酶反应器具有更高的酶解效率。马俊峰^[9]对比了牛血清白蛋白(BSA)经固定化胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶两种酶反应器酶解与仅用一种酶的反应器(胰蛋白酶:25% ;胰凝乳蛋白酶:17% )酶解的效果,BSA得到了更高的序列覆盖率(33% )。Temporini等^[10]将胰蛋白酶和糜蛋白酶通过与环氧基团一步反应同时固定到硅胶整体柱上,获得了更高的酶解效率。总而言之,不同的蛋白酶对不同的氨基酸位点有不同的酶切位点,因此选择合适的酶在固定化过程中非常重要。

1.2 固定酶的方法

固定酶的方法是影响固定化酶反应器性能的主要因素之一,最常用的4种方法为吸附法、共价键合法、包埋法和交联法。

1.2.1 吸附法

吸附法是最早使用的未经过化学修饰固定酶的方法,这种方法具有如下优势:改变条件能够使吸附的酶解吸附,使得载体能够重复利用;操作条件温和;保持了酶的活性。当然,这种方法也有不少缺点,如固定化的酶特别容易流失,这是由于酶与载体之间的作用力相对较弱,因此极易受到离子强度、pH值的影响。吸附法常通过氢键作用^[11]、范德华力、亲水作用、静电作用^{[12, 13]}将酶固定到载体上。除此之外,利用Cu^{2+^{[8, 14]}螯合也是重要的固定酶的方法之一。}

1.2.2 共价键合法

为了使酶的流失减小到最低,目前使用最多的是共价键合法。与吸附法相比,利用共价键合法固定的酶具有更高的稳定性,能够在极性溶剂中使用,不会因为底物和盐的存在而发生流失。但是化学反应可能会使酶发生变性,导致其活性减弱甚至会失去活性,化学反应也会使酶失去一些重要的活性位点。共价键合法主要通过与相应的常见的基团^[15]反应将酶固定到载体上,例如环氧基^[10]、醛基和琥珀酰亚胺^[16]、羧基^{[17, 18, 19]}等。

1.2.3 包埋法

酶的包埋通常是指利用物理或者化学的方法将酶包埋在某种载体中的过程。包埋法与吸附法相比,能够减少酶的流失,与共价键合法相比,酶的活性较高。但是如果制备过程不成功,会严重地阻碍底物与酶的接触,降低酶解效率。较为常见的包埋法是将酶包埋在聚丙烯酰胺凝胶中^{[20, 21, 22]}。

1.2.4 交联法

与共价键合法不同,交联法是使用双功能或多功能的试剂使载体与酶分子之间进行共价交联的固定方法。由于反应的条件通常比较剧烈,因此对酶的活性影响较大,在使用的过程中应尽可能地使用较低浓度的交联剂并且缩短交联的时间,在温和条件下进行交联反应有利于保持酶的活性,最为常用的交联试剂为戊二醛^{[23, 24, 25]}。

1.3 固定化酶的载体

载体性质对于保持固定化酶的活性有极为重要的作用,目前最为常见的载体基质材料包括纳米材料、整体材料、聚合物材料以及膜材料。

1.3.1 纳米材料

纳米材料由于具有较大的比表面积、能够显著地提高固酶量、具有良好的生物相容性等优点而被广泛用作固定化酶载体。近年来,氧化石墨烯一直是研究的热点。氧化石墨烯具有表面积大,表面含有多种基团例如环氧基、羟基、羧基等,易于被修饰,能够在水溶液中分散,亲水性好,能显著减少分析过程中蛋白质和肽段的非特异性吸附等特点而被用作固定化酶的载体。2012年,Jiang等^[11]用磁性Fe₃O₄修饰氧化石墨烯,先将磁性Fe₃O₄修饰上氨基,加入1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺(EDC)和N-羟基硫代琥珀酰亚胺(NHS)活化氧化石墨烯上的羧基基团,制备出GO-CO-NH-Fe₃O₄纳米复合材料,最后将胰蛋白酶通过 π - π 堆积和氢键作用固定到氧化石墨烯层上,制备成固定化酶反应器。这种复合材料由于修饰了Fe₃O₄纳米颗粒,酶解后酶解液与固酶基质在磁场作用下能够被轻易分离。Yin等^[12]利用层层静电自组装在毛细管内壁吸附上石墨烯,将酶通过静电作用吸附到石墨烯层上制备多层固定化酶反应器。微流控芯片由于具有集成化程度高、便于携带、样品和试剂用量小等特点而应用广泛。Chen等^[18]在聚甲基丙烯酸酯微流控芯片的内壁通道上包上一层氧化石墨烯-二氧化硅复合物,并用EDC和NHS活化石墨烯上的羧基,将胰蛋白酶共价键合到氧化石墨烯表面。Shieh等^[26]将糜蛋白酶通过共价键合固定到Fe₃O₄-壳聚糖纳米颗粒上,固定的酶能在磁场下选择性分离以降低运行成本,较高的比表面积能够提供较多的共价位点,壳聚糖的存在使得这种载体无毒性,具有生物相容性、可生物降解性和抗菌特性,并且能在生物催化系统中连续地使用。

Malvi等^[27]用吸附法将胰蛋白酶吸附到叠氮化物修饰的SBA-15(直径5～8 μ m)介孔材料上,然后用炔基修饰的介孔硅纳米材料覆盖,采用叠氮化炔点击化学法(CuAAC),用Cu(I)作催化剂,将胰蛋白酶包埋在两种材料之间。由于介孔硅纳米颗粒是一种多孔结构,并且孔的大小适当,孔径大小能够允许反应物(蛋白质)和生成物(肽段)自由出入,但是酶不会发生流失。Hartmann课题组^[28]将脂肪酶通过戊二醛交联以及共价键合两种方法固定到有序介孔硅材料上。这种材料是一种笼状的结构,在这种材料中,修饰硅材料的有机功能基团是均匀分布的,这些基团不会堵塞材料上的孔,并且易于制备。通过改变有机基团就可以改变材料的亲水性和反应活性等。

1.3.2 整体材料

整体材料^{[29, 30, 31]}作为固定化酶的重要载体之一,由于其结构可改变、消除了柱填充的麻烦、网状小孔结构能够减小反压、易于修饰等特点,一直受到广泛的关注。整体柱大致可以分为3类:无机整体柱^[32]、有机整体柱^{[20, 21, 22, 33]}、有机-无机杂化整体柱^{[14, 19, 34, 35]}。

无机整体柱具有表面积大、不会在有机溶剂中发生溶胀、高温下稳定、孔径可调、适用于大分子和小分子物质分析等优点而被广泛使用,但是其制备步骤繁琐,且pH适用范围为2～8。由于聚多巴胺能够沉积在多种载体上,作为前体进一步地为引入下一步的功能基团做准备,多巴胺中的邻苯二酚基团还能与多种亲核物质例如巯基、氨基、咪唑基等反应^{[36, 37]}。2012年,Messersmith等^[32]在碱性条件下将多巴胺聚合修饰在二氧化硅-二氧化钛复合整体基质上,并且将胰蛋白酶固定到聚多巴胺修饰层上,由于在二氧化硅基质中加入了二氧化钛,从而显著提高了硅胶柱在极端pH环境的稳定性。

相比较于无机整体柱,有机整体柱具有使用pH范围较宽、制备过程较为简便等优点而被用于蛋白质、肽段、核酸等的分离以及酶的固定。Foo课题组^[20]将胰蛋白酶(共价键合)、糖苷酶(包埋)分别固定到右旋糖酐(经羧基和氨基修饰)修饰的毛细管柱和聚丙烯酰胺整体柱上,经过右旋糖酐修饰后的毛细管柱具有表面积大的特点,因此能够固定更多的胰蛋白酶。聚丙烯酰胺整体柱则具有通透性好、固定后酶的活性高、传质快等特点。将两种固定化酶反应器进行串联,对红细胞生成素进行酶解,得到的肽段通过液相色谱-电喷雾串联质谱(LC-ESI-MS/MS)分析,获得了良好的结果。Dovichi课题组^[21]制备了基于聚丙烯酰胺整体柱的固定化酶反应器,首先利用硅烷化试剂在毛细管中引入双键,然后聚合制备丙烯酰胺整体柱,将聚合材料(包括丙烯酰胺、N-丙烯酰氧基琥珀酰亚胺(NAS)、聚乙二醇(PEG)、N,N,N′,N′-四甲基乙二胺(TEMED)和过硫酸铵(APS))与胰蛋白酶混合后通入毛细管进行聚合反应,反应器长度只有7 cm。蛋白酶解生成后的肽段直接通过毛细管区带电泳分离后进入质谱检测。邹汉法课题组^[22]将酶-聚乙二醇-酶抑制剂包埋在聚丙烯酰胺凝胶内,并将其应用于电泳中,制备了一种能够在一次运行中分别完成蛋白质电泳分离和酶解的固定化酶反应器。该固定化酶反应器首先在碱性条件下抑制酶的活性,对蛋白质复杂样品进行聚丙烯酰胺凝胶电泳分离,然后在低pH下释放酶的活性,对电泳分离后的蛋白质进行酶解。2013年,Krenkova等^[33]将肽-N-糖苷酶F固定到修饰后的聚甲基丙烯酸酯-Co-乙二醇二甲基丙烯酸酯整体柱上,整体柱经过谷胱甘肽、琥珀酰亚胺基-6-[(碘乙酰基)氨基]己酸修饰后,将肽-N-糖苷酶F固定到整体柱上,用于糖蛋白上多糖的释放,然后用8-氨基芘-1,3,6-三磺酸三钠盐(APTS)标记多糖进行毛细管电泳-激光诱导荧光检测法分离检测。

有机-无机杂化整体柱中同时存在有机和无机组分,无机部分可提供机械强度稳定的聚合骨架,而结合于无机相上且均匀分布的有机基团可以改善材料的性能。有机-无机杂化整体柱具有无机整体柱、有机整体柱两者的优势:pH适用范围广,制备步骤简单,不受有机溶剂影响。

张维冰课题组^[8]利用戊二醛交联和Cu²⁺螯合将胰蛋白酶和糜蛋白酶固定到掺杂SBA-15的有机-无机杂化整体柱上,两种酶分别固定到整体基质和SBA-15纳米颗粒上。与传统的单酶反应器相比,双酶反应器具有更高的酶解效率,通过对比将单酶反应器与双酶反应器酶解鼠肝膜蛋白的效率,该课题组发现双酶反应器显著增加了肽段个数。

张玉奎课题组^{[14, 19, 34, 35]}做了一系列的工作。首先,以四氧基硅烷、3-氨丙基三乙氧基硅烷为单体,十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)为模板剂,水为引发剂,在毛细管内聚合制备有机-无机杂化整体柱,然后通过戊二醛将酶交联到整体柱上。先通过反相液相色谱进行蛋白质分离,利用中空纤维膜接口切换进入固定化酶反应器的溶剂以利于酶解,酶解的肽段经反相液相色谱分离,强阳离子交换柱除盐后利用基质辅助激光解吸电离-飞行时间质谱(MALDI-TOF MS)分析。该课题组又以四甲氧基硅烷、乙烯基三甲氧基硅烷为单体,水解缩聚形成硅胶骨架,并在骨架形成过程中加入甲基丙烯酸,形成有机-无机杂化整体柱,同时以聚乙烯亚胺修饰,加入EDC和NHS活化羧基,共价键合上胰蛋白酶。这种甲基丙烯酸-二氧化硅杂化整体柱的亲水性较强,对蛋白质和酶解肽段几乎没有吸附,通透性好。该课题组通过一步法制备了一种有机-无机杂化整体柱,聚合单体为 γ -(甲基丙烯酰氧)丙基三甲氧基硅烷,首先将 γ -缩水甘油醚丙基三甲氧基硅烷(GLYMO)与金属螯合试剂亚氨基二乙酸(IDA)反应,生成的产物为溶液A,然后通过四乙氧基硅烷(TEOS)的水解得到溶液B,将两溶液按一定比例混合后通入毛细管反应形成有机-无机整体基质,最后再通入Cu²⁺螯合固定胰蛋白酶,并用鼠肝提取物进行了评价。相对于自由溶液酶解(483个),制备的酶反应器酶解产物中检测出了更多的蛋白质(541个),而酶解时间从24 h缩短到15 s。

1.3.3 聚合物材料

聚合物材料因制备简单、易于修饰且具有良好的生物相容性而被广泛用作固定酶的载体。钱小红课题组^[23]利用转移自由基聚合(SI-ATRP)技术将胰蛋白酶共价键合到修饰后的Fe₃O₄纳米磁性颗粒上。首先在Fe₃O₄纳米磁性颗粒上修饰上一层二氧化硅,然后用硅烷化试剂引入三乙氧基硅烷基团,利用表面原子引起的自由基转移聚合技术,在修饰后的纳米磁性颗粒表面形成毛发链状亲水性聚合物,用于固定胰蛋白酶。2014年,该课题组^[24]又使用相同的方法,在修饰后的纳米磁性颗粒表面形成毛发链状亲水性聚合物和疏水性聚合物,形成一种双基质的载体。相比较于其他方法,这种方法能够很好地控制聚合的密度和结构,得到的毛发状聚合物为胰蛋白酶的固定提供了足够大的表面积和更多的共价结合位点,固酶量显著提高。同时聚合物链之间是非交联的,因此蛋白质能够深度进入聚合物链内部,增加了蛋白质与酶接触的几率,从而减少了酶解时间;另外,固定化蛋白酶的磁性纳米颗粒能够很容易地用磁铁移除,相比较于自由溶液酶解,其具有更高的酶解效率。采用双基质载体固定胰蛋白酶后,利用酵母和鼠肝膜蛋白对其进行评价,经亲水和疏水酶反应器酶解后只有60%的重复率,显示出较强的互补性。Ma等^[25]将左旋天冬酰胺酶固定到聚(2-乙烯基-4,4-二甲基吖内酯)(PVDMA)修饰的Fe₃O₄纳米颗粒上,固酶量达到318.0 μ g/mg。PVDMA具有很好的生物相容性,经PVDMA修饰的这种磁性纳米材料具有操作性强、多功能性、显著提高酶活性等特点。为减少蛋白质和肽段在固定化酶反应器中的非特异性吸附,2012年,张玉奎课题组^[38]用N-乙烯基-吡咯烷酮修饰聚丙烯酸酯微球来提高载体亲水性,减少非特异性吸附,然后将胰蛋白酶共价键合到修饰后的聚丙烯酸酯微球上,最后将微球填充到毛细管柱内制备成胰蛋白酶反应器。

1.3.4 膜材料

膜材料由于其广泛的应用价值而备受关注,在血液透析、消毒、污水处理等方面都起着至关重要的作用。随着电子束激发技术的发现,Schulze等^{[39, 40, 41]}利用该技术将膜表面直接嫁接上有机功能分子,通过这种方法改变膜的亲水性。Starke等^[42]采用一步法利用电子束激发将胰蛋白酶通过共价键合固定到膜材料上,并对膜的多孔性、膜的机械强度进行了考察,用二喹啉甲酸(bicinchoninic acid,BCA)法测定固定酶的浓度,固定到孔径为0.2 μ m聚醚砜膜和聚偏二氟乙烯膜上的胰蛋白酶分别达到了3.48 μ g/cm²和2.46 μ g/cm²。实验表明通过电子束激发这种技术固定上的酶具有良好的活性。Feng等^[43]将过氧化氢酶通过Cu²⁺螯合固定到聚乙烯醇/尼龙6(PVA/PA6)膜上制备成膜反应器,基于多孔膜材料的酶反应器具有同时进行酶解反应与产物分离的能力,加快了酶解反应的速度,提高了转化率，在这种材料上的固酶量达到了(64.0±4.6) mg/g。

2 总结与展望

固定化酶反应器作为蛋白质组学研究中“bottom-up”策略重要的组件,在蛋白质鉴定过程中扮演着重要的角色。与自由溶液酶解相比,固定化酶反应器具有众多的优点,最为重要的是固定化酶反应器能够与多种仪器联用,例如HPLC、CE、MS等在线联用,从而建立起分析平台,对于发展蛋白质的快速鉴定具有重要的意义。近年来,多种新颖的载体已用于固定化酶,制备新型的固定化酶反应器仍然是当前的热点。此外,固定化酶反应器与多种仪器联用以及其兼容性考察也是重要的研究方向。

参考文献

[1]	Switzar L, Giera M, Niessen W M A. J Proteome Res, 2013, 12(3): 1067
[2]	Compton P D, Zamdborg L, Thomas P M, et al. Anal Chem, 2011, 83(17): 6868
[3]	Hartmann M, Kostrov X. Chem Soc Rev, 2013, 42(15): 6277
[4]	Magner E. Chem Soc Rev, 2013, 42(15): 6213
[5]	Sheldon R A, van Pelt S. Chem Soc Rev, 2013, 42(15): 6233
[6]	Lakouraj M M, Maashsani A, Norouzian R S, et al. J Carbohydr Chem, 2015, 34(2): 103
[7]	Bian Y Y, Ye M L, Song C X, et al. J Proteome Res, 2012, 11(5): 2828
[8]	Shangguan L L, Zhang L Y, Xiong Z C, et al. J Chromatogr A, 2015, 1388: 158
[9]	Ma J F. [PhD Dissertation]. Dalian: Dalian Institute of Chemical Physics, Chinese Academy of Sciences (马俊峰. [博士学位论文]. 大连: 中国科学院大连化学物理研究所), 2009
[10]	Temporini C, Calleri E, Cabrera K, et al. J Sep Sci, 2009, 32(8): 1120
[11]	Jiang B, Yang K G, Zhao Q, et al. J Chromatogr A, 2012, 1254: 8
[12]	Yin Z R, Zhao W W, Tian M M, et al. Analyst, 2014, 1397(7): 1973
[13]	Min W N, Wang W P, Chen J R, et al. Anal Bioanal Chem, 2012, 404(8): 2397
[14]	Ma J F, Hou C Y, Liang Y, et al. Proteomics, 2011, 11(5): 991
[15]	Zhou Z, Hartmann M. Top Catal, 2012, 55(16): 1081
[16]	Li Y H, Wojcik R, Dovichi N J, et al. J Chromatogr A, 2011, 1218: 2007
[17]	Sun L L, Li Y H, Yang P, et al. J Chromatogr A, 2012, 1220: 68
[18]	Bao H M, Zhang L Y, Chen G. J Chromatogr A, 2013, 1310: 74
[19]	Yuan H M, Zhang L H, Zhang Y K. J Chromatogr A, 2014, 1371: 48
[20]	Foo H C, Smith W N, Stanley M R S. Talanta, 2015, 135: 18
[21]	Sun L L, Zhu G J, Dovichi N J, et al. Anal Chem, 2013, 85(8): 4187
[22]	Liu F J, Ye M L, Wang C L, et al. Anal Chem, 2013, 85(15): 7024
[23]	Qin W J, Song Z F, Fan C, et al. Anal Chem, 2012, 84(7): 3138
[24]	Fan C, Shi Z M, Pan Y T, et al. Anal Chem, 2014, 86(3): 1452
[25]	Mu X Y, Qiao J, Qi L, et al. Appl Mater Interfaces, 2014, 6(23): 21346
[26]	Ju H Y, Kuo C H, Too J R, et al. J Mol Catal B: Enzym, 2012, 78: 9
[27]	Malvi B, Gupta S S. Chem Commun, 2012, 48(63): 7853
[28]	Zhou Z, Piepenbreier F, Marthala V R R, et al. Catal Today, 2015, 243: 173
[29]	Arrua R D, Talebi M, Causon T J, et al. Anal Chim Acta, 2012, 738: 1
[30]	Connolly D, Currivan S, Paull B. Proteomics, 2012, 12(19): 1
[31]	Walsh Z, Paull B, Macka M. Anal Chim Acta, 2012, 750: 28
[32]	Rivera J G, Messersmith P B. J Sep Sci, 2012, 35(12): 1514
[33]	Krenkova J, Szekrenyes A, Keresztessy Z, et al. J Chromatogr A, 2013, 1322: 54
[34]	Ou J J, Lin H, Zhang Z B, et al. Electrophoresis, 2013, 34(1): 126
[35]	Yuan H M, Zhou Y, Xia S M, et al. Anal Chem, 2012, 84(11): 5124
[36]	Zeng R J, Luo Z F, Zhou D, et al. Electrophoresis, 2010, 31(19): 3334
[37]	Jia M, Qin L, He X W, et al. J Mater Chem, 2012, 22: 707
[38]	Jiang H, Yuan H M, Liang Y, et al. J Chromatogr A, 2012, 1246: 111
[39]	Schulze A, Marquardt B, Kaczmarek S, et al. Macromol Rapid Commun, 2010, 31(5): 467
[40]	Schulze A, Marquardt B, Went M, et al. Water Sci Technol, 2012, 65(3): 574
[41]	Schulze A, Maitz M F, Zimmermann R, et al. RSC Adv, 2013, 3(44): 22518
[42]	Starke S, Went M, Prager A, et al. React Funct Polym, 2013, 73(5): 698
[43]	Feng Q, Zhao Y, Wei A F, et al. Environ Sci Technol, 2014, 48(17): 10390

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... ^{[3, 4, 5]}。决定酶固定成功与否及其酶解性能的因素主要包括酶的种类的选择、 ...[View in article]

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... 水解酶切位点有苯基丙氨酸、色氨酸、酪氨酸、亮氨酸残基。胃蛋白酶^[6]作为唯一在酸性条件下使用的水解酶,它倾向于剪切氨基端或羧基端为 ...[View in article]

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... 低,尤其对于缺少赖氨酸和精氨酸残基的蛋白质(如疏水性膜蛋白)。Bian等^[7]将Glu-C与胰蛋白酶串联使用对HeLa细胞进行自由溶液酶解,显著地提高了 ...[View in article]

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... pH与胰蛋白酶接近,常被应用于多酶共同酶解以提高酶解效率。Shangguan等^[8]将糜蛋白酶和胰蛋白酶同时固定到掺杂介孔氧化硅材料SBA-15的有机-无 ...[View in article]

... 将酶固定到载体上。除此之外,利用Cu^{2+^{[8, 14]}螯合也是重要的固定酶的方法之
...[View in article]}

... 张维冰课题组^[8]利用戊二醛交联和Cu²⁺螯合将胰蛋白酶和糜蛋白酶固定到掺杂SBA ...[View in article]

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... 整体柱上,获得的双酶反应器比单酶反应器具有更高的酶解效率。马俊峰^[9]对比了牛血清白蛋白(BSA)经固定化胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶两种酶反应 ...[View in article]

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... 凝乳蛋白酶:17% )酶解的效果,BSA得到了更高的序列覆盖率(33% )。Temporini等^[10]将胰蛋白酶和糜蛋白酶通过与环氧基团一步反应同时固定到硅胶整体柱 ...[View in article]

... 反应将酶固定到载体上,例如环氧基^[10]、醛基和琥珀酰亚胺^[16]、羧 ...[View in article]

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... 相对较弱,因此极易受到离子强度、pH值的影响。吸附法常通过氢键作用^[11]、范德华力、亲水作用、静电作用^{[12[View in article]}

... 质和肽段的非特异性吸附等特点而被用作固定化酶的载体。2012年,Jiang等^[11]用磁性Fe₃O₄修饰氧化石墨烯,先将磁性Fe₃O_{4[View in article]}

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... 范德华力、亲水作用、静电作用^{[12, 13]}将酶固定到载体上。除此之外,利 ...[View in article]

... 纳米颗粒,酶解后酶解液与固酶基质在磁场作用下能够被轻易分离。Yin等^[12]利用层层静电自组装在毛细管内壁吸附上石墨烯,将酶通过静电作用吸 ...[View in article]

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... 、范德华力、亲水作用、静电作用^{[12, 13]}将酶固定到载体上。除此之外,利用Cu^{2+^{[[View in article]}}

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... 定到载体上。除此之外,利用Cu^{2+^{[8, 14]}螯合也是重要的固定酶的方法之一。
...[View in article]}

... 有机-无机杂化整体柱^{[14, 19, 34,
...[View in article]}

... 张玉奎课题组^{[14, 19, 34,
...[View in article]}

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... 酶失去一些重要的活性位点。共价键合法主要通过与相应的常见的基团^[15]反应将酶固定到载体上,例如环氧基^{[10<
...[View in article]}

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... 氧基^[10]、醛基和琥珀酰亚胺^[16]、羧基^{[17,
...[View in article]}

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... 醛基和琥珀酰亚胺^[16]、羧基^{[17, 18, 19]
...[View in article]}

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... 羧基^{[17, 18, 19]}等。 ...[View in article]

... 集成化程度高、便于携带、样品和试剂用量小等特点而应用广泛。Chen等^[18]在聚甲基丙烯酸酯微流控芯片的内壁通道上包上一层氧化石墨烯-二氧 ...[View in article]

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... ^{[17, 18, 19]}等。 ...[View in article]

... 有机-无机杂化整体柱^{[14, 19, 34, 35]
...[View in article]}

... 张玉奎课题组^{[14, 19, 34, 35]
...[View in article]}

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... 接触,降低酶解效率。较为常见的包埋法是将酶包埋在聚丙烯酰胺凝胶中^{[20, 21, 22]<
...[View in article]}

... :无机整体柱^[32]、有机整体柱^{[20, 21, 22,
...[View in article]}

... 等优点而被用于蛋白质、肽段、核酸等的分离以及酶的固定。Foo课题组^[20]将胰蛋白酶(共价键合)、糖苷酶(包埋)分别固定到右旋糖酐(经羧基和氨 ...[View in article]

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... 法是将酶包埋在聚丙烯酰胺凝胶中^{[20, 21, 22]}。 ...[View in article]

... 有机整体柱^{[20, 21, 22, 33]<
...[View in article]}

... 色谱-电喷雾串联质谱(LC-ESI-MS/MS)分析,获得了良好的结果。Dovichi课题组^[21]制备了基于聚丙烯酰胺整体柱的固定化酶反应器,首先利用硅烷化试剂 ...[View in article]

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... 较为常见的包埋法是将酶包埋在聚丙烯酰胺凝胶中^{[20, 21, 22]}。 ...[View in article]

... ^{[20, 21, 22, 33]}、有机-无机杂化整体柱 ...[View in article]

... 后的肽段直接通过毛细管区带电泳分离后进入质谱检测。邹汉法课题组^[22]将酶-聚乙二醇-酶抑制剂包埋在聚丙烯酰胺凝胶内,并将其应用于电泳中 ...[View in article]

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... 条件下进行交联反应有利于保持酶的活性,最为常用的交联试剂为戊二醛^{[23, 24, 25]<
...[View in article]}

... 饰且具有良好的生物相容性而被广泛用作固定酶的载体。钱小红课题组^[23]利用转移自由基聚合(SI-ATRP)技术将胰蛋白酶共价键合到修饰后的Fe_{3<
...[View in article]}

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... 性,最为常用的交联试剂为戊二醛^{[23, 24, 25]}。 ...[View in article]

... 粒表面形成毛发链状亲水性聚合物,用于固定胰蛋白酶。2014年,该课题组^[24]又使用相同的方法,在修饰后的纳米磁性颗粒表面形成毛发链状亲水性 ...[View in article]

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... 最为常用的交联试剂为戊二醛^{[23, 24, 25]}。 ...[View in article]

... 亲水和疏水酶反应器酶解后只有60%的重复率,显示出较强的互补性。Ma等^[25]将左旋天冬酰胺酶固定到聚(2-乙烯基-4,4-二甲基吖内酯)(PVDMA)修饰的 ...[View in article]

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... NHS活化石墨烯上的羧基,将胰蛋白酶共价键合到氧化石墨烯表面。Shieh等^[26]将糜蛋白酶通过共价键合固定到Fe₃O₄-壳聚糖纳米颗粒 ...[View in article]

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... Malvi等^[27]用吸附法将胰蛋白酶吸附到叠氮化物修饰的SBA-15(直径5～8 μ m)介孔材 ...[View in article]

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... 物(蛋白质)和生成物(肽段)自由出入,但是酶不会发生流失。Hartmann课题组^[28]将脂肪酶通过戊二醛交联以及共价键合两种方法固定到有序介孔硅材料 ...[View in article]

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... 整体材料^{[29, 30, 31]<
...[View in article]}

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... 整体材料^{[29, 30, 31]}作为固定化酶的重要载体之一,由 ...[View in article]

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... ^{[29, 30, 31]}作为固定化酶的重要载体之一,由于其结构可改变、消除了柱填充的麻 ...[View in article]

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... 修饰等特点,一直受到广泛的关注。整体柱大致可以分为3类:无机整体柱^[32]、有机整体柱^{[20, <
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... 2012年,Messersmith等^[32]在碱性条件下将多巴胺聚合修饰在二氧化硅-二氧化钛复合整体基质上, ...[View in article]

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... 有机整体柱^{[20, 21, 22, 33]}、有机-无机杂化整体柱 ...[View in article]

... 在低pH下释放酶的活性,对电泳分离后的蛋白质进行酶解。2013年,Krenkova等^[33]将肽-N-糖苷酶F固定到修饰后的聚甲基丙烯酸酯-Co-乙二醇二甲基丙 ...[View in article]

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... 有机-无机杂化整体柱^{[14, 19, 34, 35]}。 ...[View in article]

... ^{[14, 19, 34, 35]}做了一系列的工作。首先,以四氧 ...[View in article]

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... 有机-无机杂化整体柱^{[14, 19, 34, 35]}。 ...[View in article]

... 张玉奎课题组^{[14, 19, 34, 35]}做了一系列的工作。首先,以四氧基硅烷、3-氨丙基三乙氧基硅烷为 ...[View in article]

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... 中的邻苯二酚基团还能与多种亲核物质例如巯基、氨基、咪唑基等反应^{[36, 37]}。2012年,Messersmith等 ...[View in article]

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... 质例如巯基、氨基、咪唑基等反应^{[36, 37]}。2012年,Messersmith等^[32]在碱 ...[View in article]

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... 蛋白质和肽段在固定化酶反应器中的非特异性吸附,2012年,张玉奎课题组^[38]用N-乙烯基-吡咯烷酮修饰聚丙烯酸酯微球来提高载体亲水性,减少 ...[View in article]

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... 理等方面都起着至关重要的作用。随着电子束激发技术的发现,Schulze等^{[39, 40, 41]<
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... 着电子束激发技术的发现,Schulze等^{[39, 40, 41]}利用该技术将膜表面直接嫁接上 ...[View in article]

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... ^{[39, 40, 41]}利用该技术将膜表面直接嫁接上有机功能分子,通过这种方法改变膜的 ...[View in article]

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... 膜表面直接嫁接上有机功能分子,通过这种方法改变膜的亲水性。Starke等^[42]采用一步法利用电子束激发将胰蛋白酶通过共价键合固定到膜材料上, ...[View in article]

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... 。实验表明通过电子束激发这种技术固定上的酶具有良好的活性。Feng等^[43]将过氧化氢酶通过Cu²⁺螯合固定到聚乙烯醇/尼龙6(PVA/PA6)膜上制 ...[View in article]