超高效液相色谱仪(Waters公司,ACQUITY UPLC H class型),配置四元泵溶剂淋洗系统、自动进样系统和便携式QDa质谱检测器。色谱柱BEH C₁₈色谱柱(50 mm×2.1 mm,1.7 μ m,Waters公司)。纯水器(Sartorius公司,Arium 611DI型)。C₁₈填料(50 g,Supelco公司),Oasis HLB填料(10 g,Waters公司),带真空泵的12位固相萃取装置(Supelco公司)。

双烯雌酚(dienestrol,DE,纯度97.5% )、醋酸甲羟孕酮(medroxyprogesterone acetate,MPA,纯度98.5% )、甲基睾丸酮(methyltestosterone,MT,纯度99.8% )、苯甲酸雌二醇(estradiol benzoate,EB,纯度99.5% )、丙酸睾酮(testosterone propionate,TP,纯度98.5% )、孕酮(progesterone,PT,纯度97.5% )、睾酮(testosterone,T,纯度98.5% )、双氢睾酮(androstan-17-ol-3-one,AT,纯度99.8% ),左炔诺孕酮(levonorgestrol,LG,纯度98.5% )均购于德国Dr. Ehrenstorfer公司,结构式见图1。

乙腈、甲醇均为色谱纯(Merck公司),乙酸铵、甲酸为优级纯,国药集团化学试剂有限公司,其余试剂为分析纯。

除苯甲酸雌二醇用丙酮溶解外,其他标准品均用甲醇溶解,配制成500 mg/L 标准储备液,于4 ℃冰箱中保存。

分别用甲醇逐级稀释,配制5个浓度的混合标准溶液,质量浓度为5、10、20、50、100 μ g/L(其中AT和DE的质量浓度高10倍,为50、100、200、500、1 000 μ g/L)。

图 1

Fig. 1

图 1 9种类固醇激素的分子结构式 Fig. 1 Chemical structures of the nine estrogenic steroids

准确量取5 mL牛奶样品,加入10 mL甲酸-乙腈(5 ∶ 95,v/v)混合溶液,涡旋混匀,加入1 g氯化钠和4 g无水硫酸钠,混匀,以 5 000 r/min离心5 min;取5 mL上清液,氮气吹至0.5 mL,加0.5 g HLB填料,在通风橱中放置10 min,挥干有机相,充分研磨,均匀装入底部垫上滤纸的10 mL注射器,上层再垫一片滤纸,并把填料轻轻压紧。先用6 mL水冲洗,不收集;抽真空10 min,以去除柱中残留水分。最后以2 mL甲醇洗脱3次,收集洗脱液,室温下氮吹至近干,用乙腈-0.1%(v/v)甲酸水溶液(2 ∶ 8,v/v)定容至1 mL,混匀,经0.2 μ m有机相滤膜过滤,上机分析。

BEH C₁₈色谱柱(50 mm×2.1 mm,1.7 μ m);柱温35 ℃;进样量4 μ L;流动相为0.1%(v/v)甲酸水溶液(含0.05 g/L乙酸铵)(A)-乙腈(B)(80 ∶ 20,v/v),流动相梯度:0～3 min,80%A～40%A(保持1 min); 4～5 min,40%A～20%A(保持1 min); 6 min回到初始状态。流速0.3 mL/min; MSD扫描方式:正、负离子同时扫描;扫描质量数范围:m/z 30～400;毛细管电压:0.8 kV; Selected ion recording (SIR)扫描模式,锥孔电压15 V,采样速率8点/s。定量离子和保留时间如表1。

表 1 (Table 1)

表 1 9种类固醇激素的定量离子和保留时间 Table 1 Quantitative ions and retention times of the nine estrogenic steroids Component Quantitative ion (m/z) Retention time/min T 289 3.411 MT 303 3.648 AT 291 3.901 TP 313 3.947 PT 315 4.511 MPA 387 4.586 DE 267 4.781 LG 345 5.201 EB 377 5.276

表 1 9种类固醇激素的定量离子和保留时间 Table 1 Quantitative ions and retention times of the nine estrogenic steroids

由于MSD为便携式质谱仪,简化了传统质谱仪需要标准品进行优化质谱电压的繁琐操作,通过全扫描模式(正/负离子)可确定目标化合物的保留时间和监测离子,这些化合物均在正离子模式下出峰,其定量离子见表1。

对色谱分离条件和MSD性能进行考察。按照1.3节色谱条件对100 μ g/L 混合标准溶液进行分离,SIR模式检测。当流动相A相选择为水时,只有PT、T、TP、MPT、LG和MT等6个化合物出峰。A相为氨水(0.05% ,pH=9)时,与水为流动相的结果一致。当选择酸(0.1%(v/v)甲酸水溶液,含0.05 g/L乙酸铵)为流动相时,才能保证9个化合物同时出峰。同时研究发现,流动相比例对PT、T、TP、MPT、LG和MT等6个化合物的峰响应影响大,这6个化合物在A相/B相(80/20,v/v)条件下的相应比A相/B相(40/60,v/v)条件下峰高响应高10倍,但对AT、EB和DE这3个化合物的峰高响应没有影响。有机相使用乙腈比使用甲醇时目标物的峰响应高。从图1可知,PT、T、TP、MPT、LG和MT等6个化合物均含有环己烯酮,在酸性条件下容易电离,AT为环己酮、EB和DE为酚酸,酸性条件不容易电离,因此MSD正离子模式对吸电子基团化合物灵敏度更高,受流动相影响大。

由于流动相同时影响灵敏度和分离度,通过优化条件,选择A相为0.1%(v/v)甲酸水溶液(含0.05 g/L乙酸铵),B相为乙腈,初始比例为80%A,梯度洗脱,6 min内能完全分离9种类固醇激素,其中AT和DT、PT和MPA、LG和EB的保留时间相差0.036～0.075 min,分离度R分别为1.0、1.5、1.5,体现了UPLC的分离优势,相比文献^[16]采用LC-MS/MS的18 min分离条件,分离时间缩短为原来的1/3(见图2)。

图 2

Fig. 2

图 2 选择离子检测(SIR)扫描模式下类固醇激素标准溶液的质谱图 Fig. 2 Mass spectra of a standard mixture of the nine estrogenic steroids in selected ion recording (SIR) mode

由于便携式MSD为ESI电离模式,可能存在基质效应(离子增强或离子抑制)。基质效应(ME)可以表示为同一添加浓度的被分析物在基质中的信号与分析物在有机溶剂中的信号比值,如公式(1):

图 3

Fig. 3

图 3 采用两种溶剂萃取时类固醇激素的基质效应 Fig. 3 Matrix effects of the estrogenic steroids with two extraction solvents

参照文献选择乙腈^[16]和酸性乙腈^[17]作为萃取溶剂,按照1.2.2节萃取方法对添加100 μ g/kg 混合标准溶液的牛奶样品进行基质效应考察,结果见图3。从图3可知,以乙腈或者甲酸-乙腈(5 ∶ 95,v/v)作萃取溶剂时,T、TP和MT等3个化合物有明显的基质效应,但以甲酸-乙腈(5 ∶ 95,v/v)作萃取溶剂时其他化合物的基质效应低于乙腈作萃取溶剂,因此选择甲酸-乙腈(5 ∶ 95,v/v)作为提取溶液。

MSPD的原理是将样品和键合固定相载体混合研磨使样品组织细胞碎裂,待测组分通过扩散进入键合的有机相,然后选择合适洗脱强度的溶剂把待测组分洗脱出来。常用的键合固定相有C₁₈等^[21]。在牛奶中加入100 μ g/kg 混合标准品,按照1.2.2节样品处理,比较C₁₈和HLB填料对牛奶的净化效果和目标化合物的回收率。由于HLB为N-乙烯吡咯烷酮和亲脂性二乙烯基苯聚合而成,对亲水亲脂基质有吸附,对牛奶样品的净化效果比亲脂的C₁₈性能好,从目标化合物MT的色谱图(m/z 303,图4)可看出,HLB对杂质(4.892和5.187 min)的净化效率比C₁₈的高,图5为加标牛奶样品的典型色谱图,每个通道目标化合物均能很好地定性定量。

图 4

Fig. 4

图 4 两种填料净化后的加标样品色谱图(m/z 303) Fig. 4 Chromatograms of a spiked sample with two MSPD (m/z 303)

图 5

Fig. 5

图 5 加标牛奶样品的色谱图 Fig. 5 Chromatograms of a spiked milk sample

通过HLB填料净化后,9种类固醇激素的基质效应由84% ～160%变为80% ～121% ,基本消除基质效应的影响,回收率可以达到75% ～100% ;但使用C₁₈填料净化,还是不能消除T、TP和MT的基质效应。

采用1.2.1节方法制备混合标准溶液,按优化后的检测条件进样,以各定量离子的峰面积对质量浓度做标准曲线,得到9种化合物的线性方程及其相关系数。9种类固醇激素在5～100 μ g/L(其中AT、DE和EB为50～1 000 μ g/L)范围内线性关系良好,其检出限(LOD)(根据S/N=3计算)和方法的定量限(LOQ)(根据S/N=10计算)见表2。从表2可知,T、TP、PT这几种化合物的灵敏度达到欧盟对牛奶中类固醇激素残留限量要求和接近文献^[16]LC-MS/MS方法的灵敏度,AT、DE和EB的灵敏度比LC-MS/MS差很多。

表 2 (Table 2)

表 2 回归方程、相关系数(R2)、检出限及定量限 Table 2 Regression equations,correlation coefficients (R2),limits of detection (LODs) and limits of quantification (LOQs) Component Regression equation R2 LOD/( μ g/kg) LOQ/( μ g/kg) T Y=2.57×105X+1.19×104 0.995 1 2 MT Y=3.48×105X+1.07×104 0.999 0.5 2 AT Y=1.36×103X+4.44×103 0.993 15 20 TP Y=2.37×105X+0.28×104 0.999 1 2 PT Y=5.37×105X+2.92×104 0.999 0.5 2 MPA Y=4.51×105X+1.93×104 0.999 1 2 DE Y=1.12×103X+3.55 ×103 0.994 10 20 EB Y=1.45×103X+2.84×103 0.994 10 20 LG Y=4.01×105X+2.97×104 0.995 0.5 2 Y: peak area,mV×s; X: mass concentration,μ g/L.

表 2 回归方程、相关系数(R2)、检出限及定量限 Table 2 Regression equations,correlation coefficients (R2),limits of detection (LODs) and limits of quantification (LOQs)

将100 μ g/L 的混合标准溶液在一天内重复测定5次,计算每个目标化合物峰面积的相对标准偏差(RSD);在5天内每天重复进样测定,计算每个目标化合物峰面积的RSD,结果表明,9种类固醇激素的日内精度和日间精密度分别为0.87% ～1.78%和1.82% ～3.79% ,表明9种类固醇激素在常温下是稳定的。

选择空白牛奶,分别添加5、50、100 μ g/kg进行回收率和重复性试验,每个水平重复5次测定。结果见表3。从表3可知,所有目标化合物的回收率在68.7% ～94.7% 之间,RSD小于10% 。

表 3 (Table 3)

表 3 方法的准确度和精密度(n=5) Table 3 Recoveries and relative standard deviations (RSDs) of the method (n=5) Component Added/( μ g/kg) Recovery/% RSD/% T 5 92.2 4.15 50 89.5 3.18 100 94.7 4.12 MT 5 86.7 6.98 50 90.1 4.32 100 91.7 2.17 AT 50 68.7 8.98 500 70.1 4.02 1000 71.7 3.17 TP 5 86.7 6.98 50 80.1 4.02 100 94.7 3.17 PT 5 86.7 4.08 50 84.1 5.32 100 81.7 2.17 MPA 5 73.4 8.98 50 80.1 5.72 100 76.7 4.17 DE 50 72.3 8.38 500 80.6 6.32 1000 78.7 5.17 EB 50 76.7 7.08 500 80.1 6.32 1000 81.7 2.12 LG 5 86.7 4.38 50 80.1 6.62 100 94.7 3.17

表 3 方法的准确度和精密度(n=5) Table 3 Recoveries and relative standard deviations (RSDs) of the method (n=5)

本工作建立了基质固相分散-UPLC-MSD同时测定牛奶中9种类固醇激素残留量的方法,研究发现MSD对含有吸电子基团的化合物灵敏度高,受流动相影响大,初始化流动相中酸比例高,峰响应值高。对基质固相填料的考察发现,经HLB填料净化后,可有效降低基质效应,而C₁₈填料不能消除T、TP和MT等化合物的基质效应。